[發(fā)明專利]檢測血清中幽門螺旋桿菌抗體含量的試劑盒及其使用方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202010124942.6
• 申請日: 2020-02-27
• 公開（公告）號: CN111208291A
• 公開（公告）日: 2020-05-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 丁建華;劉振世;顧麗;薛婷;王琳;龐吉豐
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇澤成生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N33/533;G01N33/535;G01N33/569
• 代理公司: 上海聯(lián)科律師事務(wù)所 31350
• 代理人: 趙旭

本發(fā)明公開了生物化學(xué)相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域的檢測血清中幽門螺旋桿菌抗體含量的試劑盒及其使用方法，檢測血清中幽門螺旋桿菌抗體含量的試劑盒，包括相互獨立包裝的抗試劑A、抗試劑B、磁微粒試劑、校準品、質(zhì)控品、清洗液和發(fā)光底物；本發(fā)明采用以磁微粒子作為免疫反應(yīng)的固相，利用化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析方法與化學(xué)發(fā)光類測定儀器配合，用于測定人體血清中的幽門螺旋桿菌抗體含量，并且可以在全自動化學(xué)發(fā)光儀上同時測定多個樣本，實現(xiàn)幽門螺旋桿菌抗體的高通量快速化測定，準確度高，特異性強，精確度和檢測效率有了較大的提高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物化學(xué)相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及檢測血清中幽門螺旋桿菌抗體含量的試劑盒及其使用方法。

背景技術(shù)

幽門螺旋桿菌是一種彎曲、螺旋形或S形的革蘭染色陰性微需氧桿菌。1979年澳大利亞學(xué)者Warren及Marshall首次從胃黏膜分離培養(yǎng)出幽門螺桿菌，隨后發(fā)現(xiàn)消化性潰瘍和慢性胃炎的首要病因是幽門螺旋桿菌。幽門螺旋桿菌屬于臨床上常見的革蘭氏陰性桿菌，主要分布在機體的胃部、十二指腸等區(qū)域中，可能造成胃粘膜慢性炎癥，嚴重者甚至出現(xiàn)胃及十二指腸潰瘍或者胃癌，直接威脅患者生命安全，受到醫(yī)療界重點關(guān)注。幽門螺旋桿菌能夠輕易穿透胃粘膜，從而生長于胃上皮細胞，同時促進大量尿素酶產(chǎn)生，將其分解后可在菌體周邊形成堿性的“氨云”，以此抵抗胃內(nèi)酸性環(huán)境，從而避免被胃酸殺滅。幽門螺旋桿菌是目前公認的慢性胃炎、消化性潰瘍和胃癌的致病因素之一，已被世界衛(wèi)生組織列為I類致癌源。幽門螺桿菌(HP)感染率極高，在發(fā)達國家占成年人的30～50％，發(fā)展中國家為40～80％，中國流行學(xué)調(diào)查結(jié)果為40～90％平均為59％。幽門螺旋桿菌中包括CanA、Urease及VacA三種分型，其中CagA并無細胞毒性作用，可能與VacA轉(zhuǎn)錄能力存在密切相關(guān)性；而VacA能夠改變上皮細胞空泡樣，并使其受損、壞死甚至發(fā)生潰瘍。

目前已知的幽門螺旋桿菌抗體測定方法有酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、膠乳增強比濁法等。酶聯(lián)免疫吸附法存在檢測時間長、操作復(fù)雜、重復(fù)性差、不適于急診和臨床病人及時診斷的需要。膠乳增強免疫比濁法操作簡單、快速，但是靈敏度低、低值重復(fù)性差。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)存在以上的技術(shù)問題，本發(fā)明提供檢測血清中幽門螺旋桿菌抗體含量的試劑盒及其使用方法。

基于以下技術(shù)原理：異硫氰酸熒光素(FITC)標記的HP抗原與堿性磷酸酶(AP)標記的HP抗原和樣本、校準品或質(zhì)控品中的HP抗體結(jié)合形成“三明治”復(fù)合物。隨后加入連有抗FITC抗體的磁微粒，通過抗FITC抗體與FITC的特異性結(jié)合使抗原抗體免疫復(fù)合物結(jié)合在磁微粒上。在外加磁場的作用下，將免疫反應(yīng)形成的復(fù)合物與未結(jié)合的其他物質(zhì)分離，清洗復(fù)合物后，加入酶促化學(xué)發(fā)光底物。底物在酶作用下被催化裂解，形成不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)中間體，當激發(fā)態(tài)中間體回到基態(tài)時發(fā)出光子，形成發(fā)光反應(yīng)，即可使用化學(xué)發(fā)光儀檢測反應(yīng)的發(fā)光強度。在檢測范圍內(nèi)，發(fā)光強度與樣本中的HP抗體的含量成正比，使用改良的四參數(shù)Logistic方程擬合可計算出樣本中HP抗體濃度。

本發(fā)明的技術(shù)方案為：

檢測血清中幽門螺旋桿菌抗體含量的試劑盒，包括相互獨立包裝的抗試劑A、抗試劑B、磁微粒試劑、校準品、質(zhì)控品、清洗液和發(fā)光底物；

所述抗試劑A為包括異硫氰酸熒光素標記的幽門螺旋桿菌抗體連接物的BSA緩沖溶液；所述抗試劑A通過包括以下步驟的操作制備而成：

Sa1：用抗試劑緩沖液將異硫氰酸熒光素配制成濃度為1.0～5.0mg/mL的異硫氰酸熒光素溶液；

Sa2：向幽門螺旋桿菌抗體中加入所述幽門螺旋桿菌抗體質(zhì)量1.1～1.5倍的所述異硫氰酸熒光素溶液并充分混合；

Sa3：用pH為8～9的碳酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH平衡，再用凝膠層析分離純化制得異硫氰酸熒光素標記的幽門螺旋桿菌抗體包被抗體；