[發(fā)明專(zhuān)利]一種對(duì)海產(chǎn)品諾如病毒GII.4的檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010121404.1
• 申請(qǐng)日: 2020-02-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111187861B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-05-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 余乃通;陳中元;曾偉偉;劉志昕
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/70
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/70;C12Q1/6844;C12R1/93
• 代理公司: 北京國(guó)坤專(zhuān)利代理事務(wù)所(普通合伙) 11491
• 代理人: 趙紅霞

本發(fā)明公開(kāi)了一種對(duì)海產(chǎn)品諾如病毒GII.4的檢測(cè)方法，涉及生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，其技術(shù)方案要點(diǎn)是：將RT?LAMP反應(yīng)產(chǎn)物加入到經(jīng)Fe³⁺淬滅后的氧化釩量子點(diǎn)溶液中，第一次觀察氧化釩量子點(diǎn)溶液的熒光強(qiáng)度變化；然后加入硫酸鎂溶液，觀察混合液中的是否有白色沉淀產(chǎn)生以及第二次觀察氧化釩量子點(diǎn)溶液的熒光強(qiáng)度變化；若觀察結(jié)果滿足以下標(biāo)準(zhǔn)條件中的任意兩種及以上，則判斷待檢測(cè)樣品含有諾如病毒，標(biāo)準(zhǔn)條件如下：第一次觀察熒光強(qiáng)度變大；混合液中的有白色沉淀產(chǎn)生；第二次觀察熒光強(qiáng)度相對(duì)于第一次觀察熒光強(qiáng)度變小。本發(fā)明能有效提高對(duì)海產(chǎn)品中諾如病毒檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可靠性，并使得諾如病毒檢測(cè)過(guò)程操作更為簡(jiǎn)單、成本降低。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，它涉及一種對(duì)海產(chǎn)品諾如病毒GII.4的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

諾如病毒(Norovirus,NV)是一種線性單鏈的正鏈RNA杯狀病毒，病毒粒子在27-35nm之間，基因組大小為7400-7700nt左右。諾如病毒含有3個(gè)開(kāi)放閱讀框(open?readingframe,ORF)，ORF1編碼一個(gè)大的多聚蛋白，隨后被病毒NS6蛋白切割成6種非結(jié)構(gòu)蛋白；而ORF2和ORF3分別編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白，與病毒核衣殼相關(guān)。諾如病毒可分6個(gè)基因組(GI-GVI)，引起人類(lèi)病毒性急性胃腸炎的主要為GI、GII和GIV，其中GII.4與病毒爆發(fā)聯(lián)系最為緊密。

諾如病毒可以在室溫下長(zhǎng)時(shí)間存活，可通過(guò)污染的水源、食物、物品、空氣等傳播，因此全年均有流行。諾如病毒可以通過(guò)人與人傳播、食物傳播和飲水傳播等。諾如病毒感染后發(fā)病快，通常在24-48h感染者就出現(xiàn)腹瀉、嘔吐、惡心等癥狀。因此，諾如病毒對(duì)人類(lèi)的生活和健康危害性極大，為此開(kāi)展食品中諾如病毒的檢測(cè)具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(LAMP)是2000年開(kāi)發(fā)的一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法，其特點(diǎn)是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶在等溫條件(63℃左右)保溫30－60分鐘，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。與常規(guī)PCR相比，不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳及紫外觀察等過(guò)程。LAMP是一種全新的核酸擴(kuò)增方法，具有簡(jiǎn)單、快速、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。該技術(shù)在靈敏度、特異性和檢測(cè)范圍等指標(biāo)上能媲美甚至優(yōu)于PCR技術(shù)，不依賴任何專(zhuān)門(mén)的儀器設(shè)備實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)高通量快速檢測(cè)，檢測(cè)成本遠(yuǎn)低于熒光定量PCR。

然而，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法的靈敏度高，一旦開(kāi)蓋容易形成氣溶膠污染，假陽(yáng)性問(wèn)題比較嚴(yán)重，常需要結(jié)合實(shí)時(shí)濁度儀進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)才能保證環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法檢測(cè)的準(zhǔn)確性，其使用限制較大。因此，研究設(shè)計(jì)一種簡(jiǎn)單的、準(zhǔn)確的檢測(cè)海產(chǎn)品中諾如病毒技術(shù)是我們目前迫切需要解決的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種對(duì)海產(chǎn)品諾如病毒GII.4的檢測(cè)方法，有效避免光背景以及氣溶膠污染對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，提高了對(duì)海產(chǎn)品中諾如病毒檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可靠性；同時(shí)，此方法即不需要實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)(RT-PCR)所需的昂貴儀器，也不需要LAMP中的實(shí)時(shí)濁度儀，使得諾如病毒檢測(cè)過(guò)程操作更為簡(jiǎn)單、成本降低。

本發(fā)明的上述技術(shù)目的是通過(guò)以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：一種對(duì)海產(chǎn)品諾如病毒GII.4的檢測(cè)方法，包括以下步驟：

S1：選取海產(chǎn)品作為待檢測(cè)樣品，并進(jìn)行RNA提取；

S2：采用RT-LAMP技術(shù)對(duì)RNA提取物進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增，得到RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物；

S3：將RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物加入到經(jīng)Fe³⁺淬滅后的氧化釩量子點(diǎn)溶液中，第一次觀察氧化釩量子點(diǎn)溶液的熒光強(qiáng)度變化；

S4：將硫酸鎂溶液加入到RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物與氧化釩量子點(diǎn)溶液的混合液中，觀察混合液中的是否有白色沉淀產(chǎn)生以及第二次觀察氧化釩量子點(diǎn)溶液的熒光強(qiáng)度變化；