[發(fā)明專利]一種對海產(chǎn)品諾如病毒GII.4的檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010121404.1
• 申請日: 2020-02-26
• 公開（公告）號(hào): CN111187861B
• 公開（公告）日: 2023-05-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 余乃通;陳中元;曾偉偉;劉志昕
• 申請（專利權(quán)）人: 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/6844;C12R1/93
• 代理公司: 北京國坤專利代理事務(wù)所(普通合伙) 11491
• 代理人: 趙紅霞

1.一種海產(chǎn)品諾如病毒GII.4的檢測方法，其特征是，包括以下步驟：

S1：選取海產(chǎn)品作為待檢測樣品，并進(jìn)行RNA提取；

S2：采用RT-LAMP技術(shù)對RNA提取物進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增，得到RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物；

S3：將RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物加入到經(jīng)Fe³⁺淬滅后的氧化釩量子點(diǎn)溶液中，第一次觀察氧化釩量子點(diǎn)溶液的熒光強(qiáng)度變化；

S4：將硫酸鎂溶液加入到RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物與氧化釩量子點(diǎn)溶液的混合液中，觀察混合液中是否有白色沉淀產(chǎn)生以及第二次觀察氧化釩量子點(diǎn)溶液的熒光強(qiáng)度變化；

S5：若觀察結(jié)果滿足以下標(biāo)準(zhǔn)條件中的任意兩種及以上，則判斷RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物含有焦磷酸根離子，RNA提取物在S2中完成特異性擴(kuò)增，待檢測樣品含有諾如病毒，標(biāo)準(zhǔn)條件如下：

a.第一次觀察熒光強(qiáng)度變大；

b.混合液中有白色沉淀產(chǎn)生；

c.第二次觀察熒光強(qiáng)度相對于第一次觀察熒光強(qiáng)度變小；

其中，RNA提取物進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增中的RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)液包括：

正向內(nèi)引物：ACGACCCTCTCCCCCTTGTACCCTTACAGGAGACCAGCGT；

反向內(nèi)引物：TCCAAGATGCCCTCAGATTGCACTGTCACAGTTCAGGGTGAG；

正向外引物：GCTAAGAGAATCGCAGCCTC；

反向外引物：CGCTGTCAAAGACCTTTCCT。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種海產(chǎn)品諾如病毒GII.4的檢測方法，其特征是，在步驟S1中，所述待檢測樣品的RNA提取具體方法為：

選取海產(chǎn)品樣品，洗凈外表污物；將海產(chǎn)品樣品置于0.1-0.2mol/L的生理鹽水中排污20-30min后取出，余下液體為待處理液；對待處理液離心處理，并取上清液進(jìn)行RNA提取。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種海產(chǎn)品諾如病毒GII.4的檢測方法，其特征是，在步驟S2中，所述RNA提取物進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增的具體方法為：

將10-20μL的RNA提取物加入到100μL的RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)液中，加入40-50U/μL的AMV反轉(zhuǎn)錄酶以及5-8μL的鏈置換DNA聚合酶，在63-65℃范圍內(nèi)的等溫條件下恒溫?cái)U(kuò)增30-60min，得到RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物；

所述RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)液包括：反應(yīng)緩沖液、1.0-1.6mmol/L的dNTP、0.8-1.6μmol/L正向內(nèi)引物、0.8-1.6μmol/L反向內(nèi)引物、0.2-0.4μmol/L正向外引物、0.2-0.4μmol/L反向外引物、1.0-1.5mol/L的甜菜堿；

其中，所述反應(yīng)緩沖液含有200mM的pH為8.8的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、80mM氯化鉀、100mM硫酸銨、20mM硫酸鉀和1％曲拉通X-100。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種海產(chǎn)品諾如病毒GII.4的檢測方法，其特征是，在步驟S3中，所述氧化釩量子點(diǎn)溶液具體為：氧化釩量子點(diǎn)含量為15-25mM、體積為10-20μL的溶液。