[發(fā)明專利]一種表達雜萜類化合物的重組釀酒酵母及其構(gòu)建方法和應用

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• 申請日: 2020-02-26
• 公開（公告）號: CN113999783A
• 公開（公告）日: 2022-02-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張云豐;羅小舟;許薷芳;李宗瑾
• 申請（專利權(quán)）人: 森瑞斯生物科技（深圳）有限公司
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12P7/42;C12R1/865
• 代理公司: 深圳市港灣知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44258
• 代理人: 劉向英

本發(fā)明公開了一種表達雜萜類化合物的重組釀酒酵母及其構(gòu)建方法和應用,通過在表達大麻萜酚酸的釀酒酵母中引入外源的大麻色素合成酶，通過轉(zhuǎn)化入攜帶外源大麻色素合成酶基因的質(zhì)粒，或在釀酒酵母染色體上整合外源大麻色素合成酶基因，獲得表達雜萜類化合物的重組釀酒酵母，如將PCR擴增416d上游序列、416d下游序列、Gal1啟動子序列、ADH1終止子序列、經(jīng)密碼子優(yōu)化的ProA?CBCAS序列得到的產(chǎn)物與質(zhì)粒pCUT?416d共同轉(zhuǎn)化入釀酒酵母中。該重組釀酒酵母具有高效表達雜萜類化合物的優(yōu)點，可用于發(fā)酵生產(chǎn)雜萜類化合物。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及合成生物學技術(shù)領(lǐng)域基因工程改造技術(shù)，具體涉及一種表達雜萜類化合物的重組釀酒酵母、其構(gòu)建方法和在工業(yè)生產(chǎn)雜萜類化合物方面的應用。

背景技術(shù)

雜萜類化合物(Merotepenoid)是很多天然產(chǎn)物藥物的前提或藥物本身，在醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域中得到了廣泛的應用。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作為重要的真核模式生物，被廣泛的用作天然產(chǎn)物生物合成的重要底盤細胞，被廣泛用作表達包括雜萜類化合物在內(nèi)的多種天然產(chǎn)物及其類似物的生物合成。與原核生物大腸桿菌(Escherichiacoli)相比，其具有與其他真核生物相似的復雜胞內(nèi)組織結(jié)構(gòu)，有利于從物理上隔離不同的生化反應類型從而提高生化反應的正交性和效率。與畢赤酵母(Pichiapastoris)相比，釀酒酵母是國際上公認的食品級安全級微生物，不產(chǎn)生毒素，表達產(chǎn)物不需要經(jīng)過大量安全性實驗。因此，構(gòu)建雜萜類化合物高效表達的釀酒酵母菌株，對工業(yè)生產(chǎn)具有重要的應用價值和實踐意義。雜萜類化合物在釀酒酵母中的表達通常是通過結(jié)合內(nèi)源及外源的合成途徑，然而，由于內(nèi)源途徑的復雜調(diào)節(jié)方式及外源途徑的酶的缺失或效率不佳，導致包括雜萜類化合物在內(nèi)的多種天然產(chǎn)物的表達量不佳，成為這些化合物在釀酒酵母中高效表達的瓶頸問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種表達雜萜類化合物的重組釀酒酵母及其構(gòu)建方法和應用。

為解決上述的技術(shù)問題，本發(fā)明的一種實施方式采用以下技術(shù)方案：

第一方面，本發(fā)明提供一種表達雜萜類化合物的重組釀酒酵母的構(gòu)建方法，該方法在表達大麻萜酚酸的釀酒酵母中引入外源的大麻色素合成酶，獲得表達雜萜類化合物的重組釀酒酵母。

所述的表達雜萜類化合物的重組釀酒酵母的構(gòu)建方法中，引入外源的大麻色素合成酶的方法是：通過轉(zhuǎn)化入攜帶外源大麻色素合成酶基因的質(zhì)粒，或在釀酒酵母染色體上整合外源大麻色素合成酶基因。

所述的表達雜萜類化合物的重組釀酒酵母的構(gòu)建方法中，所述外源大麻色素合成酶基因至少包括經(jīng)密碼子優(yōu)化的ProA-CBCAS序列通過PCR擴增得到的產(chǎn)物。

所述的表達雜萜類化合物的重組釀酒酵母的構(gòu)建方法中，可以將PCR擴增經(jīng)密碼子優(yōu)化的ProA-CBCAS序列得到的產(chǎn)物與質(zhì)粒pCUT-416d共同轉(zhuǎn)化入釀酒酵母中。

所述的表達雜萜類化合物的重組釀酒酵母的構(gòu)建方法中，可以在轉(zhuǎn)化時使用PCR擴增416d上游序列、416d下游序列、Gal1啟動子序列、ADH1終止子序列得到的產(chǎn)物與PCR擴增經(jīng)密碼子優(yōu)化的ProA-CBCAS序列得到的產(chǎn)物一起進行轉(zhuǎn)化。

所述的表達雜萜類化合物的重組釀酒酵母的構(gòu)建方法中，轉(zhuǎn)化的步驟包括：

活化釀酒酵母細胞，然后在YEPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD₆₀₀升至0.7-1.0之間，收集細胞，將含有所述產(chǎn)物與質(zhì)粒pCUT-416d的轉(zhuǎn)化液與細胞混合，30℃保溫孵育后42℃熱激，收集細胞。

所述的表達雜萜類化合物的重組釀酒酵母的構(gòu)建方法中，一個轉(zhuǎn)化量的所述轉(zhuǎn)化液包括：120ul 50％PEG3350，18uL 1mol/L LiAC，5uL 10mg/mL單鏈魚精DNA，35uL無菌水和2ug由所述產(chǎn)物與質(zhì)粒pCUT-416d混合構(gòu)成的待轉(zhuǎn)化片段。