[發(fā)明專利]一種表達雜萜類化合物的重組釀酒酵母及其構建方法和應用

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• 申請日: 2020-02-26
• 公開（公告）號: CN113999783A
• 公開（公告）日: 2022-02-01
• 發(fā)明（設計）人: 張云豐;羅小舟;許薷芳;李宗瑾
• 申請（專利權）人: 森瑞斯生物科技（深圳）有限公司
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12P7/42;C12R1/865
• 代理公司: 深圳市港灣知識產(chǎn)權代理有限公司 44258
• 代理人: 劉向英

1.一種表達雜萜類化合物的重組釀酒酵母的構建方法，其特征在于，在表達大麻萜酚酸的釀酒酵母中引入外源的大麻色素合成酶，獲得表達雜萜類化合物的重組釀酒酵母。

2.根據(jù)權利要求1所述的表達雜萜類化合物的重組釀酒酵母的構建方法，其特征在于，所述引入外源的大麻色素合成酶，是通過轉化入攜帶外源大麻色素合成酶基因的質(zhì)粒，或在釀酒酵母染色體上整合外源大麻色素合成酶基因。

3.根據(jù)權利要求2所述的表達雜萜類化合物的重組釀酒酵母的構建方法，其特征在于，所述外源大麻色素合成酶基因至少包括經(jīng)密碼子優(yōu)化的ProA-CBCAS序列通過PCR擴增得到的產(chǎn)物。

4.根據(jù)權利要求3所述的表達雜萜類化合物的重組釀酒酵母的構建方法，其特征在于，將PCR擴增經(jīng)密碼子優(yōu)化的ProA-CBCAS序列得到的產(chǎn)物與質(zhì)粒pCUT-416d共同轉化入釀酒酵母中。

5.根據(jù)權利要求4所述的表達雜萜類化合物的重組釀酒酵母的構建方法，其特征在于，在轉化時使用PCR擴增416d上游序列、416d下游序列、Gal1啟動子序列、ADH1終止子序列得到的產(chǎn)物與PCR擴增經(jīng)密碼子優(yōu)化的ProA-CBCAS序列得到的產(chǎn)物一起進行轉化。

6.根據(jù)權利要求3所述的表達雜萜類化合物的重組釀酒酵母的構建方法，其特征在于，所述轉化的步驟包括：活化釀酒酵母細胞，然后在YEPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD₆₀₀升至0.7-1.0之間，收集細胞，將含有所述產(chǎn)物與質(zhì)粒pCUT-416d的轉化液與細胞混合，30℃保溫孵育后42℃熱激，收集細胞。

7.根據(jù)權利要求6所述的表達雜萜類化合物的重組釀酒酵母的構建方法，其特征在于，一個轉化量的所述轉化液包括：120ul 50％PEG3350，18uL1mol/L LiAC，5uL 10mg/mL單鏈魚精DNA，35uL無菌水和2ug由所述產(chǎn)物與質(zhì)粒pCUT-416d混合構成的待轉化片段。

8.根據(jù)權利要求4所述的表達雜萜類化合物的重組釀酒酵母的構建方法，其特征在于，以YEPD固體培養(yǎng)基及營養(yǎng)缺陷型固體培養(yǎng)基SC-URA3共同培養(yǎng)轉化后的釀酒酵母，篩選引入了大麻色素合成酶且脫去pCUT-416d質(zhì)粒的釀酒酵母。

9.采用權利要求1-8任意一項所述的構建方法得到的表達雜萜類化合物的重組釀酒酵母。

10.權利要求9所述的重組釀酒酵母發(fā)酵生產(chǎn)雜萜類化合物的應用。