[發明專利]一種基于片段分析技術的拷貝數變異通用驗證方法

有效

• 申請號: 202010120719.4
• 申請日: 2020-02-26
• 公開（公告）號: CN111206076B
• 公開（公告）日: 2021-12-03
• 發明（設計）人: 趙書民
• 申請（專利權）人: 上海晶準生物醫藥有限公司;趙書民
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858
• 代理公司: 上海申新律師事務所 31272
• 代理人: 郎祺

本發明涉及生物技術領域，公開了一種基于片段分析技術的拷貝數變異(CNV)通用驗證方法：包括用于構建多重內標測量系統(MISS)的多態性遺傳標記篩選原則；設計用于擴增多態性遺傳標記的PCR引物和CNV區域內的PCR引物；對樣本進行擴增并對擴增產物進行毛細管電泳片段分析，得到各個位點的基因型、各擴增產物峰的峰高或峰面積；通過MISS和z檢驗對CNV拷貝數進行驗證。本發明提供的這種基于片段分析技術的拷貝數變異的驗證方法適用于人基因組任意位置CNV的拷貝數驗證；用于構建MISS系統的遺傳標記與待驗證CNV可以連鎖也可以不連鎖；不受CNV拷貝數是增加還是減少的影響；拷貝數結果基于嚴格的統計學檢驗，可靠性更高。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種基于片段分析技術的人基因組中拷貝數變異的拷貝數驗證方法。

背景技術

基因組DNA水平的變異研究是人的分子遺傳研究的核心問題之一。依據基因變異所涉及人基因組DNA片段的大小，可分為(1)微小變異：通常涉及單個或多個核苷酸的變化；(2)拷貝數變異(Copy Number Variations，CNVs)：通常指長度涉及1kb或以上的DNA片段的缺失(拷貝數減少)、重復(拷貝增加)等；(2)染色體倍型變化：指至少1條或多條染色體數目的變化，如游離型的21三體綜合征即是由于21號染色體完整增加了1條所致。其中，CNVs的研究是目前相關研究中的熱點之一。

在全基因組范圍內，傳統的高分辨率核型分析技術(Yunis,1978；Trask,2002)可分辨約5Mb以上的拷貝數變化。隨著分子生物學技術手段的發展，已出現一些更高通量的基于分子手段的CNVs檢測方法，如比較基因組雜交(aCGH)技術、基于單核苷酸多態性的基因芯片技術(Manning and Hudgins,2010)，以及基于二代測序的CNVs檢測方案(CN201680067423.2)。理論上，對于基于高通量分子檢測方案所發現的特定區域的CNVs都需要采用不同的技術方案進行驗證。

用于特定區域的CNVs的驗證方案已有多種，包括多重連接探針擴增技術(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA，Schouten等，2002)以及更為常用的實時熒光定量技術(qPCR)。qPCR需要在CNV區域設計引物與熒光探針，并采用單拷貝的內參基因通過相對定量的方式實現對特定CNV區域拷貝數計數(如申請號為201810096023.5的專利技術)。該方案操作相對簡單，但所需要的引物與探針的設計要求較高，尤其是當CNVs區域存在高度同源序列時常導致相應的引物探針無法設計，而無法采用該技術方案。同時，采用實時熒光定量進行CNV拷貝數變異檢測時也通常需要制備標準曲線。

MLPA是在CNV區域的高度保守區設計兩條相鄰的探針，在探針雜交后通過連接酶反應進行探針連接，然后通過兩條探針末端的公用PCR引物進行擴增，依據信號強度對拷貝數進行相對定量。為了實現相對定量，在MLPA中需要依據其它單拷貝基因的保守區域設計多條參考探針。雖然不同的連接后探針使用公用引物進行擴增，以提供相對一致的擴增效率，但連接效率的差異仍然導致同一個反應內不同連接后探針的PCR擴增峰高存在顯著差異，校準CNVs計數的標準差較大，對結果判斷造成一定的干擾。同時MLPA的實驗操作復雜，需要通過探針雜交、連接酶反應、PCR擴增、毛細管電泳才能實現對特定CNVs拷貝數的檢驗。

近年，也有人提出了利用與CNV區域緊鄰的單個多態性位點、通過一代基因測序的方法進行特定區域CNV的驗證方案，當基因測序發現該雜合性位點只有一個等位基因時，可提示相應的CNV區域存在拷貝數的丟失(如申請號為201811492690.1的專利技術)。該方法較好地解決了部分CNVs無法采用實時熒光定量PCR方案的問題，同時通過一代基因測序的定性判斷可對缺失型CNVs的進行準確判斷；但這一方案存在的問題是，一是需要在CNVs與臨近區域(小于800bp)要找到合適的多態性位點且該位點在該樣本中為雜合狀態，二是對于拷貝數增加型的CNVs(重復)則無法采用這一技術方案進行驗證。

發明內容