[發明專利]一種基于片段分析技術的拷貝數變異通用驗證方法

有效

• 申請號: 202010120719.4
• 申請日: 2020-02-26
• 公開（公告）號: CN111206076B
• 公開（公告）日: 2021-12-03
• 發明（設計）人: 趙書民
• 申請（專利權）人: 上海晶準生物醫藥有限公司;趙書民
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858
• 代理公司: 上海申新律師事務所 31272
• 代理人: 郎祺

1.一種非診斷目的的基于片段分析技術的拷貝數變異的通用驗證方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟一，在人基因組范圍的單拷貝區域篩選n個具有高度多態性的長度多態性遺傳標記；并選擇特定的已知拷貝數的單拷貝內參基因作為質控位點；

步驟二，針對目標CNV區域和步驟一所篩選的所述長度多態性遺傳標記及質控位點按引物設計基本原則要求設計PCR引物；

步驟三，提取基因組DNA，然后對提取的所述基因組DNA進行PCR擴增；

步驟四，對步驟三擴增得到的產物進行毛細管電泳片段分析，得到各個位點的基因型、各擴增產物峰的峰高或峰面積；

步驟五，將步驟四測得的所述峰高通過下式計算待測樣本中目標CNV區域拷貝數和質控位點的拷貝數：

N＝mRR＝mR_s/R_c (式-1)

其中：

m為已知的對照樣本中目標CNV區域拷貝數；RR為R_s與R_c的比值；下標s指待測樣本，下標c指對照樣本；

h指目標CNV擴增片段的峰高；tH指n個長度多態性遺傳標記全部擴增片段的峰高和；

計算質控位點的拷貝數時，上述參數替換為質控位點相應的參數；

步驟六，對步驟五中的待測樣本中目標CNV區域拷貝數和質控位點的拷貝數N進行z檢驗：

當N＝0時，依據目標CNV區域擴增片段的峰高h＝0，即未出現CNV區域的擴增產物峰，進行定性判斷，對這一定性判斷結果不需要進行z檢驗；當N不為0時，采用下述方法構建統計量z進行檢驗：

在n個長度多態性遺傳標記中，設第i個長度多態性遺傳標記全部擴增片段的峰高和為H_i，n個長度多態性遺傳標記全部擴增片段的峰高和記為tH，計算二者之比，記為R_i，即：

計算待測樣本s與對照樣本c中對應R_i值之比RR_i：

式-2中下標s與下標c分別指待測樣本與對照樣本；

計算n個長度多態性遺傳標記的RR_i值的標準差sd：

以式-1中的RR值、n個長度多態性遺傳標記的RR_i的均值及其標準差sd，以及已知對照樣本中目標CNV區域的拷貝數m，構建統計量z：

其中，步驟五和步驟六中所出現的峰高替換為步驟四中測得的對應峰面積來計算和驗證拷貝數變異；

在對質控位點的拷貝數進行檢驗時，相應參數替換為質控位點對應的參數；步驟一中所述長度態性遺傳標記的篩選標準如下：

(1)所述長度多態性遺傳標記為插入/缺失標記或復等位基因的短串聯重復序列；其中，插入/缺失標記的兩個等位基因間長度差異在3-8bp，短串聯重復序列的重復單元為3-5bp；

(2)所述長度多態性遺傳標記在人群中的雜合度在0.3-0.8之間，個數n為5-10；

(3)所述長度多態性遺傳標記位于單拷貝區域；

所述長度多態性遺傳標記位于1-3個單倍型中，同一個所述單倍型中長度多態性遺傳標記間的最大遺傳距離小于1cM；

步驟二中所述PCR擴增的擴增體系包括：TaqDNA聚合酶、PCR緩沖液、引物組、人基因組DNA模板；

所述引物組包括多態性遺傳標記PCR引物、質控位點的PCR引物和待驗證CNV區域的PCR引物。

2.根據權利要求1所述的基于片段分析技術的拷貝數變異的驗證方法，其特征在于，步驟一中所述長度多態性遺傳標記為rs146950089、rs76897176、rs59913469、rs201750616、rs36192652、rs142599011、rs540996931或ATA26A05。

3.根據權利要求1所述的基于片段分析技術的拷貝數變異的通用驗證方法，其特征在于，所述長度多態性遺傳標記與待驗證的CNV區域連鎖或不連鎖、在同一條染色體上或不在同一條染色體上。

4.根據權利要求1所述的基于片段分析技術的拷貝數變異的通用驗證方法，其特征在于，所述引物組中各PCR引物的終反應濃度為100-300pmol/L。