[發明專利]一種表達CBDAS的重組釀酒酵母及其構建方法和應用

在審

• 申請號: 202010120594.5
• 申請日: 2020-02-26
• 公開（公告）號: CN113999870A
• 公開（公告）日: 2022-02-01
• 發明（設計）人: 張云豐;李宗瑾;許薷芳;羅小舟
• 申請（專利權）人: 森瑞斯生物科技（深圳）有限公司
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N1/19;C12P7/42;C12N9/10;C12R1/865
• 代理公司: 深圳市港灣知識產權代理有限公司 44258
• 代理人: 劉向英

本發明公開了一種表達CBDAS的重組釀酒酵母及其構建方法和應用，將CBDAS定位于釀酒酵母的內源內質網定位肽的網膜上表達，獲得表達CBDAS的重組釀酒酵母，首先以釀酒酵母的基因組為模板，通過PCR擴增得到上游同源臂416d?Up片段和下游同源臂416d?Down片段；然后以質粒pZF048或pZF049為模板，通過PCR擴增得到Gal1?CBDAS?CEN1?tADH1片段或；Gal1?CBDAS?CYB5?tADH1片段，將這些片段轉化至釀酒酵母中，獲得表達CBDAS的重組釀酒酵母，通過使用釀酒酵母自身內質網定位肽表達異源蛋白CBDAS，提高了該酶的表達活性，增加了產物CBDA的產量。

技術領域

本發明涉及合成生物學技術領域基因工程改造技術，更具體地，本發明涉及在釀酒酵母中利用內源內質網定位肽構建的CBDAS高活性表達菌株及其構建方法和應用。

背景技術

大麻素是大麻植物的次級代謝產物，隨著大麻素的工業開發和利用，2020年的產值預計達到1000億美元。目前，已發現的大麻素種類超過100種，主要包括大麻二酚(cannabidiol CBD)、四氫大麻酚(tetrahydrocannabinol,THC、大麻酚(cannabinol,CBG)和大麻環萜酚(cannabichromene,CBC)等，其中互為同分異構體CBD和THC含量最高。與致幻作用的THC相比，非精神活性的CBD具有更加良好的應用前景。CBD通過與人體大腦中的CB1受體和免疫細胞中的CB2受體結合，行使抗腫瘤、神經保護、代謝和免疫調節、抗炎抗氧化、保護心血管和護肝等功效。2018年6月25日，FDA采用優先審批程序首次批準了工業大麻植物來源的CBD處方藥Epidiolex，用于治療兩種非常嚴重且罕見的嬰兒癲癇病Dravet綜合征和Lennox-Gastut綜合癥。

工業生產上，首先是提取大麻植物合成的前體大麻二酚酸CBDA，再經過脫羧后獲得CBD。然而，從大麻植物中獲取CBDA的方法，存在培養時間長、效率低、成本高、造成生物質浪費、產品純度低和含致幻THC的風險等缺點。因此，采用合成生物學技術，以釀酒酵母為細胞工廠高效生產CBDA十分必要。CBDA從頭生物合成途徑如圖1所示，大麻萜酚酸(cannabigerolic acid,CBGA)是合成CBDA的重要前體化合物，通過大麻二酚酸合酶CBDAS轉化為CBDA。為了增加CBDA的生物合成產量，表達具有高活性的CBDAS是關鍵的步驟之一。本專利首次通過使用釀酒酵母內源內質網定位肽，將CBDAS定位于內質網膜上表達，能極大地提高CBDAS的生物活性，增加產物CBDA的產量。

發明內容

本發明克服了現有技術的不足，提供一種表達CBDAS的重組釀酒酵母及其構建方法和應用。

為解決上述的技術問題，本發明的一種實施方式采用以下技術方案：

第一方面，本發明提供了一種表達CBDAS的重組釀酒酵母的構建方法，將CBDAS定位于釀酒酵母的內源內質網定位肽的網膜上表達，獲得表達CBDAS的重組釀酒酵母。

所述的表達CBDAS的重組釀酒酵母的構建方法中，使用的內質網定位肽包括CEN1和CYB5。

所述的表達CBDAS的重組釀酒酵母的構建方法中，將CBDAS定位于釀酒酵母的內源內質網定位肽的網膜上表達的其中一種方式包括以下步驟：

(1)以釀酒酵母的基因組為模板，通過PCR擴增得到上游同源臂416d-Up片段；

(2)以釀酒酵母的基因組為模板，通過PCR擴增得到下游同源臂416d-Down片段；

(3)以質粒pZF048為模板，通過PCR擴增得到Gal1-CBDAS-CEN1-tADH1片段；

(4)將416d-Up、Gal1-CBDAS-CEN1-tADH1、416d-Down作為插入片段轉化至釀酒酵母中，獲得表達CBDAS的重組釀酒酵母。