[發(fā)明專利]一種表達(dá)CBDAS的重組釀酒酵母及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010120594.5
• 申請(qǐng)日: 2020-02-26
• 公開（公告）號(hào): CN113999870A
• 公開（公告）日: 2022-02-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張?jiān)曝S;李宗瑾;許薷芳;羅小舟
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 森瑞斯生物科技（深圳）有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/81
• 分類號(hào): C12N15/81;C12N1/19;C12P7/42;C12N9/10;C12R1/865
• 代理公司: 深圳市港灣知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44258
• 代理人: 劉向英

1.一種表達(dá)CBDAS的重組釀酒酵母的構(gòu)建方法，其特征在于將CBDAS定位于釀酒酵母的內(nèi)源內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位肽的網(wǎng)膜上表達(dá)，獲得表達(dá)CBDAS的重組釀酒酵母。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)CBDAS的重組釀酒酵母的構(gòu)建方法，其特征在于使用的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位肽包括CEN1和CYB5。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的表達(dá)CBDAS的重組釀酒酵母的構(gòu)建方法，其特征在于所述將CBDAS定位于釀酒酵母的內(nèi)源內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位肽的網(wǎng)膜上表達(dá)包括以下步驟：

(1)以釀酒酵母的基因組為模板，通過PCR擴(kuò)增得到上游同源臂416d-Up片段；

(2)以釀酒酵母的基因組為模板，通過PCR擴(kuò)增得到下游同源臂416d-Down片段；

(3)以質(zhì)粒pZF048為模板，通過PCR擴(kuò)增得到Gal1-CBDAS-CEN1-tADH1片段；

(4)將416d-Up、Gal1-CBDAS-CEN1-tADH1、416d-Down作為插入片段轉(zhuǎn)化至釀酒酵母中，獲得表達(dá)CBDAS的重組釀酒酵母。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的表達(dá)CBDAS的重組釀酒酵母的構(gòu)建方法，其特征在于所述將CBDAS定位于釀酒酵母的內(nèi)源內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位肽的網(wǎng)膜上表達(dá)包括以下步驟：

(1)以釀酒酵母的基因組為模板，通過PCR擴(kuò)增得到上游同源臂416d-Up片段；

(2)以釀酒酵母的基因組為模板，通過PCR擴(kuò)增得到下游同源臂416d-Down片段；

(3)以質(zhì)粒pZF049為模板，通過PCR擴(kuò)增得到Gal1-CBDAS-CYB5-tADH1片段；

(4)將416d-Up、Gal1-CBDAS-CYB5-tADH1、416d-Down作為插入片段轉(zhuǎn)化至釀酒酵母中，獲得表達(dá)CBDAS的重組釀酒酵母。

5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的表達(dá)CBDAS的重組釀酒酵母的構(gòu)建方法，其特征在于所述轉(zhuǎn)化至釀酒酵母的方法為醋酸鋰/PEG3350法；所述釀酒酵母是菌株ySC-31。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的表達(dá)CBDAS的重組釀酒酵母的構(gòu)建方法，其特征在于所述醋酸鋰/PEG3350法的步驟包括：將釀酒酵母接種到Y(jié)PD培養(yǎng)基中稀釋至OD值為0.2，培養(yǎng)至少4.5h，收集細(xì)胞，將含有所述插入片段與質(zhì)粒pCUT-416d的轉(zhuǎn)化液與細(xì)胞混合，42℃培養(yǎng)孵育，然后收集細(xì)胞。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的表達(dá)CBDAS的重組釀酒酵母的構(gòu)建方法，其特征在于所述插入片段的用量為：每5OD釀酒酵母菌液中的細(xì)胞，對(duì)應(yīng)使用50μL DNA混合物懸浮該細(xì)胞，50μLDNA混合物由2μg所述插入片段、250ng質(zhì)粒pCUT-416d以及足量ddH2O混合而成。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的表達(dá)CBDAS的重組釀酒酵母的構(gòu)建方法，其特征在于所述插入片段轉(zhuǎn)化至釀酒酵母后，將收集到的細(xì)胞涂布到缺少尿嘧啶的篩選平板上，獲取單克隆菌落，測(cè)序驗(yàn)證后進(jìn)行保存。

9.采用權(quán)利要求1-8任意一項(xiàng)所述的構(gòu)建方法得到的表達(dá)CBDAS的重組釀酒酵母。

10.權(quán)利要求9所述的重組釀酒酵母發(fā)酵生產(chǎn)CBDAS或CBDA的應(yīng)用。