[發(fā)明專利]豬圓環(huán)病毒CAP蛋白一步法大規(guī)模純化及內(nèi)毒素去除工藝

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010118371.5
• 申請日: 2020-02-26
• 公開（公告）號: CN111233983A
• 公開（公告）日: 2020-06-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 郭廣君;呂素芳;沈志強;韓強;曲光剛;吳信明;程立坤
• 申請（專利權(quán)）人: 郭廣君
• 主分類號: C07K14/01
• 分類號: C07K14/01;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/18
• 代理公司: 北京科億知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

1.豬圓環(huán)病毒CAP蛋白一步法大規(guī)模純化及內(nèi)毒素去除工藝，其特征在于按照以下步驟進行：

(1)取豬圓環(huán)病毒CAP蛋白發(fā)酵液，高速離心獲得菌體，將菌體重懸后用高壓均質(zhì)儀破碎菌體，獲得豬圓環(huán)病毒CAP蛋白破碎液；

(2)將豬圓環(huán)病毒CAP蛋白破碎液利用中空纖維柱澄清過濾，得到豬圓環(huán)病毒CAP蛋白上樣液；

(3)將豬圓環(huán)病毒CAP蛋白上樣液利用陽離子交換柱進行純化，隨后洗脫，得到高純度豬圓環(huán)病毒CAP蛋白洗脫液；

(4)將高純度豬圓環(huán)病毒CAP蛋白洗脫液除菌過濾后，即得高純度且內(nèi)毒素達到使用濃度的豬圓環(huán)病毒CAP蛋白液；

(5)將高純度且內(nèi)毒素達到使用濃度的豬圓環(huán)病毒CAP蛋白液測定濃度、效價及內(nèi)毒素含量，計算回收率及純度。

2.按照權(quán)利要求1所述豬圓環(huán)病毒CAP蛋白一步法大規(guī)模純化及內(nèi)毒素去除工藝，其特征在于：所述重懸中重懸液的加入量為與豬圓環(huán)病毒CAP蛋白培養(yǎng)液離心所得菌體質(zhì)量比例為10mL:1g。

3.按照權(quán)利要求1所述豬圓環(huán)病毒CAP蛋白一步法大規(guī)模純化及內(nèi)毒素去除工藝，其特征在于：所述中空纖維柱孔徑為0.65μm；中空纖維柱型號為APSEA0045HSF20SP；所述過濾用過濾器型號為液體5芯2英寸316L。

4.按照權(quán)利要求1所述豬圓環(huán)病毒CAP蛋白一步法大規(guī)模純化及內(nèi)毒素去除工藝，其特征在于：所述步驟(2)待澄清蛋白液利用中空纖維柱澄清過濾的具體操作過程為：先透過70％-80％待澄清蛋白液，然后補加體積與剩余待澄清蛋白液體積相同的生理鹽水，繼續(xù)透過，待透過的體積等于加入的生理鹽水體積后，再補加體積與剩余蛋白液體積相同的生理鹽水，如此洗濾多次后，直至不能透過，澄清過濾過程結(jié)束。

5.按照權(quán)利要求1所述豬圓環(huán)病毒CAP蛋白一步法大規(guī)模純化及內(nèi)毒素去除工藝，其特征在于：所述步驟(3)離子交換柱的填料為SP Bestarose FF；離子交換柱的型號為EC0200-GI0500H、EC0300-GI0500H；生產(chǎn)及層析系統(tǒng)為AP100S(D)。

6.按照權(quán)利要求1所述豬圓環(huán)病毒CAP蛋白一步法大規(guī)模純化及內(nèi)毒素去除工藝，其特征在于：所述步驟(3)豬圓環(huán)病毒CAP蛋白澄清液利用離子交換柱進行蛋白純化的過程為：用無菌的0.1mol/L NaOH溶液對離子交換柱沖洗3個柱體積，再用無菌水沖洗直至pH為8.0，隨后用0.2M PB溶液平衡離子交換柱至柱前柱后電導(dǎo)率一致(柱前和柱后的電導(dǎo)率都在6.5～6.6ms/cm)，pH穩(wěn)定在8.0，紫外檢測UV280基線平穩(wěn)；然后將步驟(2)所得豬圓環(huán)病毒CAP蛋白上樣液上樣，上樣結(jié)束后，用0.2M PB溶液洗去未結(jié)合的雜蛋白，待UV280值下降至低于0.100AU，再用高鹽溶液洗脫豬圓環(huán)病毒CAP蛋白，紫外檢測UV280值增加時開始收集洗脫液，待UV280值下降至低于0.100AU時停止收集。

7.按照權(quán)利要求1所述豬圓環(huán)病毒CAP蛋白一步法大規(guī)模純化及內(nèi)毒素去除工藝，其特征在于：所述步驟(3)利用離子交換柱進行離子交換時，豬圓環(huán)病毒CAP蛋白澄清液的上樣線性流速為38.20cm/h，壓力控制小于3.00bar，上樣量控制在70-80mg/ml BSA；洗脫采用的洗脫液為1.0mol/L NaCl，洗脫流速為38.20cm/h。