[發明專利]豬圓環病毒CAP蛋白一步法大規模純化及內毒素去除工藝

在審

• 申請號: 202010118371.5
• 申請日: 2020-02-26
• 公開（公告）號: CN111233983A
• 公開（公告）日: 2020-06-05
• 發明（設計）人: 郭廣君;呂素芳;沈志強;韓強;曲光剛;吳信明;程立坤
• 申請（專利權）人: 郭廣君
• 主分類號: C07K14/01
• 分類號: C07K14/01;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/18
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

本發明公開了豬圓環病毒CAP蛋白一步法大規模純化及內毒素去除工藝，取豬圓環病毒CAP蛋白發酵液，高速離心獲得菌體，將菌體重懸后用高壓均質儀破碎菌體，利用中空纖維柱澄清過濾，利用陽離子交換柱進行純化，隨后洗脫，除菌過濾后，即得高純度且內毒素達到使用濃度的豬圓環病毒CAP蛋白液。豬圓環病毒CAP蛋白回收率達到88.10％，雜蛋白去除率達到97.5％,內毒素含量控制在10000EU/mL以下。

技術領域

本發明屬于生產過程中蛋白純化技術領域，涉及豬圓環病毒CAP蛋白一步法大規模純化及內毒素去除工藝。

背景技術

亞單位疫苗(Subumit vaccine)是將編碼病原微生物的保護性抗原基因導入受體如細菌、酵母或動物細胞，使其高效表達。保護性抗原分離純化后，與佐劑聯合制成的一種能誘發機體產生抗體和免疫保護、安全性高、穩定性好、無需滅活、不含有核酸的一類疫苗。盡管很多不同種類的蛋白通過基因工程技術在體外成功表達，然而在亞單位疫苗生產下游工作中的蛋白純化技術還不夠成熟，據有人統計，亞單位疫苗分離純化成本約占到其全部成本的60％-80％。目前，食品安全要求越來越高，國家政策法規越來越嚴格，產業面臨整合重組，市場品質競爭力需要提高，精準免疫的要求，上游發展迅猛，這些因素說明獸用疫苗純化越來越重要。亞單位疫苗生產下游工程中的基因重組蛋白的分離純化技術將成為目前亞單位疫苗開發的瓶頸，也是未來最具有潛力的突破方向，更是亞單位疫苗廣泛商業化必須攻克的難題。內毒素是由革蘭氏陰性細菌在自溶裂解和生長繁殖過程中釋放,能引起人或動物發熱、彌漫性血管內凝血、內毒素血癥以及休克等毒性效應甚至死亡。因此內毒素的去除對于優化生產環節并提高生物制品的安全性非常重要。

發明內容

本發明的目的在于提供豬圓環病毒CAP蛋白一步法大規模純化及內毒素去除工藝，本發明所采用的技術方案是按照以下步驟進行：

(1)取豬圓環病毒CAP蛋白發酵液，高速離心獲得菌體，將菌體重懸后用高壓均質儀破碎菌體，獲得豬圓環病毒CAP蛋白破碎液；

(2)將豬圓環病毒CAP蛋白破碎液利用中空纖維柱澄清過濾，得到豬圓環病毒CAP蛋白上樣液；

(3)將豬圓環病毒CAP蛋白上樣液利用陽離子交換柱進行純化，隨后洗脫，得到高純度豬圓環病毒CAP蛋白洗脫液；

(4)將高純度豬圓環病毒CAP蛋白洗脫液除菌過濾后，即得高純度且內毒素達到使用濃度的豬圓環病毒CAP蛋白液；

(5)將高純度且內毒素達到使用濃度的豬圓環病毒CAP蛋白液測定濃度、效價及內毒素含量，計算回收率及純度。

進一步，重懸中重懸液的加入量為與豬圓環病毒CAP蛋白培養液離心所得菌體質量比例為10mL:1g。

進一步，中空纖維柱孔徑為0.65μm；中空纖維柱型號為APSEA0045HSF20SP；所述過濾用過濾器型號為液體5芯2英寸316L。

進一步，步驟(2)待澄清蛋白液利用中空纖維柱澄清過濾的具體操作過程為：先透過70％-80％待澄清蛋白液，然后補加體積與剩余待澄清蛋白液體積相同的生理鹽水，繼續透過，待透過的體積等于加入的生理鹽水體積后，再補加體積與剩余蛋白液體積相同的生理鹽水，如此洗濾多次后，直至不能透過，澄清過濾過程結束。

進一步，步驟(3)離子交換柱的填料為SP Bestarose FF；離子交換柱的型號為EC0200-GI0500H、EC0300-GI0500H；生產及層析系統為AP100S(D)。