[發明專利]云杉花墨天牛特異性引物及快速分子檢測方法

有效

• 申請號: 202010118264.2
• 申請日: 2020-02-26
• 公開（公告）號: CN111235283B
• 公開（公告）日: 2022-04-29
• 發明（設計）人: 宗世祥;石豐銘;陶靜;焦繼鵬;黃建東
• 申請（專利權）人: 北京林業大學;北京昌回林海生態科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12N15/11
• 代理公司: 北京文苑專利代理有限公司 11516
• 代理人: 王煒

本發明公開了屬于生物的分子檢測領域的云杉花墨天牛特異性引物及其快速檢測的方法。該方法提取天牛樣本的基因組DNA，運用PCR的方法，經瓊脂糖凝膠電泳顯像，即可實現對云杉花墨天牛快速準確地鑒定。本發明完成整個鑒定僅需2?3小時，與DNA條形碼試劑盒檢測技術相比，具有檢測時間短，不需要第三方公司測序的優點。該發明能在不受蟲態和地理種群的限制下完成鑒定工作，尤其針對卵、低齡幼蟲和蛹。本發明可用于對木質包裝材料、疫木、電纜盤、光纜盤中云杉花墨天牛的快速準確鑒定，防止媒介昆蟲被人為傳播到其他地區，能有效控制松材線蟲的進一步傳播和擴散。

技術領域

本發明涉及生物檢測技術領域，具體涉及生物的分子檢測，更具體涉及云杉花墨天牛特異性引物，以及利用該引物對云杉花墨天牛進行快速檢測的方法。

背景技術

松材線蟲病是由松材線蟲寄生松樹引起的具有毀滅性的檢疫性森林病害。中國是目前遭受松材線蟲病威脅最嚴重的國家，發生面積大，擴散速度快，我國所有松樹樹種都是松材線蟲的潛在寄主；致病力強且寄主死亡速度快，松科樹種感病后最快40d左右死亡，感病后若不采取有效措施，只需3-5年即可造成整片松林死亡，造成損失巨大，自松材線蟲入侵我國的30年來，已致死數十億株松樹。松材線蟲自身無法轉移，其自然擴散需要借助媒介昆蟲的自然活動，攜帶線蟲的媒介昆蟲還可以借助人為運輸實現遠距離的人為擴散。墨天牛屬(Monochamus)昆蟲是松樹的蛀干害蟲，同時，也是松材線蟲最主要的傳播媒介。目前，已知能攜帶松材線蟲的昆蟲全球共有46種，其中能作為松材線蟲傳播媒介的昆蟲共13種，均為墨天牛屬的昆蟲，其中云杉花墨天牛已成為我國東北地區松材線蟲的主要媒介昆蟲，紅松、樟子松、長白落葉松、日本落葉松和華北落葉松在我國已被證實為松材線蟲的自然感病寄主。

目前，云杉花墨天牛的鑒定主要依據成蟲的形態特征，與同域分布的同屬天牛(如云杉大墨天牛、云杉小墨天牛、樟子松墨天牛等)的形態特征十分相似，在其形態學鑒定工作中，需要專業的昆蟲分類學知識；同時，處于卵、低齡幼蟲、蛹三個蟲態下，云杉花墨天牛與其他天牛科昆蟲的形態亦極其相似；并且，不同地理種群的云杉花墨天牛的形態特征也存在差異，無法準確進行種類鑒定。因此，在不受蟲態和地理因素的限制下，如何實現對云杉花墨天牛快速準確地鑒定，已成為亟待解決的問題。

近些年，分子生物學的快速發展已為昆蟲快速準確地鑒定提供了強有力的技術支撐。線粒體DNA嚴格母系遺傳，其中的細胞色素氧化酶I基因(CO I)具有高度保守，結構穩定，無內含子且種間變異大的特點。因此，CO I基因常作為昆蟲DNA條形碼用于物種分類、鑒定和親緣關系的研究。在墨天牛屬昆蟲鑒定，Koutroumpa等用線粒體基因中的CO I基因和28S基因研究了歐洲樟子松墨天牛(Monochamus galloprovincialis)和云杉小墨天牛(M.sutor)間的關系；安榆林等運用RAPD技術分析了松墨天牛、云杉大墨天牛、和云杉小墨天牛的DNA多態性，可對三種天牛幼蟲進行準確鑒定；陳夢義等運用DNA條形碼試劑盒(DNAbarcoding identification kit technology)檢測技術，對墨天牛屬8個種的CO I基因進行擴增，獲得了云杉花墨天牛的標記性堿基位點(Specific bases)，以此作為鑒定云杉花墨天牛的依據。然而，上述方法均需要第三方公司參與測序，耗費時間較長，無法快速鑒定云杉花墨天牛。

發明內容

本發明的主要目的在于利用分子生物學手段，在短時間內快速、準確地對我國松材線蟲的媒介昆蟲——云杉花墨天牛，在不受蟲態和地理種群的限制下完成鑒定工作，尤其針對除成蟲和老熟幼蟲以外其它蟲態(卵、低齡幼蟲和蛹)的鑒定工作。

本發明提供的技術方案是：一種用于檢測云杉花墨天牛引物對，其上游引物核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，即5’-CTTTAATTGGAGATGACCAAATTTAT-3’，其下游引物核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示，即5’-GTTTATACCACTAGGTCGTATATTAATAACG-3’。

該引物對是采用PCR技術，經過大量的篩選實驗得到，利用PCR擴增，可獲得云杉花墨天牛的特異性DNA片段。