[發明專利]一種PBMC細胞的體外培養方法在審

申請號：	202010117815.3	申請日：	2020-02-25
公開（公告）號：	CN113106060A	公開（公告）日：	2021-07-13
發明（設計）人：	王夢軍;楊志寬;陳艷普;張雪梅;王彥	申請（專利權）人：	河南省銀豐生物工程技術有限公司;銀豐生物工程集團有限公司
主分類號：	C12N5/078	分類號：	C12N5/078;A01N1/02
代理公司：	南京君陶專利商標代理有限公司 32215	代理人：	沈根水
地址：	450000 河南省鄭***	國省代碼：	河南;41
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摘要：
搜索關鍵詞：	一種 pbmc 細胞體外培養方法
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【說明書】：

本發明公開了一種PBMC細胞的體外培養方法，包括肝素抗凝常規采血、分離外周血淋巴細胞血、分離原始PBMC細胞、原始PBMC細胞培養、干擾素處理和細胞收集和冷存。本發明的有益效果是：采血時靜脈血用ACD抗凝劑取代傳統的肝素方法抗凝，防止抗凝后交接層混濁，洗滌后沒有細胞的現象發生，培養基成分極大降低了由于長期體外培養可能出現的細胞活力減弱、微生物污染等事件的發生率，干擾素具有廣譜抗病毒作用，通過誘導細胞合成抗病毒蛋白而發揮抑制病毒的作用，冷存則延長培養后細胞的保存時長。

技術領域

本發明涉及一種PBMC細胞培養，具體為一種PBMC細胞的體外培養方法，屬于細胞培養技術領域。

背景技術

外周血單個核細胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)是外周血中具有單個核的細胞，包括淋巴細胞和單核細胞，其中淋巴細胞又包括T淋巴細胞，B淋巴細胞和NK細胞。其中T淋巴細胞是比例最多的淋巴細胞類型，在胸腺中發育成熟，主要功能就是執行人體的細胞免疫功能，在人體的免疫監視中發揮著重要的作用。B淋巴細胞屬于人體的執行體液免疫功能的細胞，B淋巴細胞受抗原刺激以后，能夠發育成熟為漿細胞，可以分泌各種抗體，發揮體液免疫功能NK細胞是人體非特異性免疫細胞，也在免疫監視中發揮著重要作用。單核細胞屬于白細胞的一種，從血液中逸出到組織中就變成了吞噬細胞，也稱為巨噬細胞，在人體的非特異性免疫功能中發揮著重要的作用。

細胞療法作為其中一種治療策略，巳經研究了數十年，其分支如干細胞治療、免疫細胞治療等的臨床運用將越來越廣泛。目前運用于臨床的細胞療法如骨髓造血干細胞移植、充質干細胞移植等已被證實是安全有效的治療手段。

免疫調節細胞因具有維持機體的中樞和外周免疫耐受的特性而備受國內外學者的青睞，大量證據表明免疫調節細胞在預防自身免疫反應，減輕諸如感染、腫瘤、器官移植等因素造成的炎癥反應和維持免疫穩態等方面均具有重要的作用，故基于調節細胞的治療將有助于機體免疫耐受重建，最終SLE乃至自身免疫性疾病患者將能達到真正“痊愈”，但是在培養這些免疫調節細胞時容易感染雜菌導致純度受損，或者保存不當造成活性喪失。

發明內容

本發明的目的就在于為了解決上述問題而提供一種PBMC細胞的體外培養方法。

本發明通過以下技術方案來實現上述目的：一種PBMC細胞的體外培養方法，包括以下步驟：

步驟一、抗凝常規采血，在采血管內添加有ACD抗凝劑，并進行抽血采集；

步驟二、分離外周血淋巴細胞血，從采集到的血液中通過離心分離出外周血淋巴細胞；

步驟三、分離原始PBMC細胞，由外周血淋巴細胞分離得到原始PBMC細胞；

步驟四、原始PBMC細胞培養，將獲得的原始PBMC細胞放入培養基中進行培養；

步驟五、干擾素處理，對培養后的原始PBMC細胞投放干擾素，影響原始PBMC細胞生長環境；

步驟六、細胞收集和冷存，將所獲得的PBMC細胞放置在細胞培養板上，并將其培養基吸出，每個孔添加20ul的Trizol，并將其培養后的細胞放入到冰箱中進行保存。

作為本發明再進一步的方案：所述步驟一中，采血時靜脈血用ACD抗凝劑以容積比血：抗凝劑＝9：1抗凝處理。

作為本發明再進一步的方案：所述步驟四中，培養原始PBMC細胞所使用的培養基由RPMI 1640+10% FBS+1% P/S和少量的胰島素樣生長因子-Ⅰ組成。

作為本發明再進一步的方案：所述步驟三中，對外周血淋巴細胞血按照血：分離液＝1：2注入國產淋巴細胞分離液TBD上層，20℃離心30分鐘，且分層時的離心溫度只能在20－25℃。