[發明專利]一種PBMC細胞的體外培養方法

在審

• 申請號: 202010117815.3
• 申請日: 2020-02-25
• 公開（公告）號: CN113106060A
• 公開（公告）日: 2021-07-13
• 發明（設計）人: 王夢軍;楊志寬;陳艷普;張雪梅;王彥
• 申請（專利權）人: 河南省銀豐生物工程技術有限公司;銀豐生物工程集團有限公司
• 主分類號: C12N5/078
• 分類號: C12N5/078;A01N1/02
• 代理公司: 南京君陶專利商標代理有限公司 32215
• 代理人: 沈根水

1.一種PBMC細胞的體外培養方法，其特征在于：包括以下步驟：

步驟一、抗凝常規采血，在采血管內添加有ACD抗凝劑，并進行抽血采集；

步驟二、分離外周血淋巴細胞血，從采集到的血液中通過離心分離出外周血淋巴細胞；

步驟三、分離原始PBMC細胞，由外周血淋巴細胞分離得到原始PBMC細胞；

步驟四、原始PBMC細胞培養，將獲得的原始PBMC細胞放入培養基中進行培養；

步驟五、干擾素處理，對培養后的原始PBMC細胞投放干擾素，影響原始PBMC細胞生長環境；

步驟六、細胞收集和冷存，將所獲得的PBMC細胞放置在細胞培養板上，并將其培養基吸出，每個孔添加20ul的Trizol，并將其培養后的細胞放入到冰箱中進行保存。

2.根據權利要求1所述的一種PBMC細胞的體外培養方法，其特征在于：所述步驟一中，采血時靜脈血用ACD抗凝劑以容積比血：抗凝劑＝9：1抗凝處理。

3.根據權利要求1所述的一種PBMC細胞的體外培養方法，其特征在于：所述步驟四中，培養原始PBMC細胞所使用的培養基由RPMI 1640+10% FBS+1% P/S和少量的胰島素樣生長因子-Ⅰ組成。

4.根據權利要求1所述的一種PBMC細胞的體外培養方法，其特征在于：所述步驟三中，對外周血淋巴細胞血按照血：分離液＝1：2注入國產淋巴細胞分離液TBD上層，20℃離心30分鐘，且分層時的離心溫度只能在20－25℃。

5.根據權利要求1所述的一種PBMC細胞的體外培養方法，其特征在于：所述步驟五中，對原始PBMC細胞進行干擾素處理，起到一定的激活作用，促進細胞表面FC受體的表達，提升免疫效果；

其中，干擾素包括培養基的終濃度的α-IFN抑制雜菌和病毒生長，且使用的干擾素需要稀釋，稀釋干擾素要用滅菌的注射用水或生理鹽水。

6.根據權利要求1所述的一種PBMC細胞的體外培養方法，其特征在于：所述步驟六中，在進行細胞收集和冷存時，需要對細胞培養板上每個孔內的培養基進行吸除，此時，用移液槍將孔壁吹打數次，然后將Trizol轉移到EP管中，最后培養的細胞冷存溫度要達到-80℃。