[發明專利]一種檢測黃牛VAMP7基因CNV標記的方法及專用試劑盒

有效

• 申請號: 202010117701.9
• 申請日: 2020-02-25
• 公開（公告）號: CN111172295B
• 公開（公告）日: 2022-07-05
• 發明（設計）人: 黃永震;劉賢;孫皓明;蔡雯雯;李莉;張子敬;于翔;楊尚;施巧婷;茹寶瑞;賀花;黃必志;雷初朝;陳宏;胡沈榮
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6851
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 范巍

本發明公開了一種檢測黃牛VAMP7基因CNV標記的方法及專用試劑盒：以黃牛的血液全基因組DNA為模板，通過實時熒光定量PCR方法分別擴增黃牛VAMP7基因CNV區域和參考基因BTF3的部分片段，根據2*2^?ΔΔCt將定量結果分為插入型、缺失型和正常型，從而鑒定黃牛VAMP7基因的拷貝數變異類型。與云嶺牛、夏南牛、皮南牛和郟縣紅牛生產數據的關聯分析顯示，正常型個體的十字部高顯著高于插入型和正常型個體。本發明通過在DNA水平上檢測與云嶺牛生長性狀密切相關的CNV標記，可用于快速建立云嶺牛等地方黃牛品種的遺傳資源優勢種群，有利于加快黃牛分子標記輔助選擇育種工作，該方法簡單、快速，便于推廣應用。

技術領域

本發明涉及家畜分子生物學檢測領域，具體涉及利用QPCR檢測黃牛VAMP7基因的拷貝數變異位點的基因型及VAMP7基因CNV標記在分子標記輔助選擇中的應用。

背景技術

自20世紀80年代以來，隨著信息技術和分子生物技術的迅猛發展，動物育種技術的研究已逐漸從宏觀的群體水平進入微觀的分子水平，與傳統的育種方法相比，動物分子育種是直接在分子水平上對性狀的基因進行選擇，因此選種和育種的準確性都更高。隨著動物分子育種理論及應用技術不斷成熟完善，肉牛分子育種工作取得了突飛猛進的發展。

拷貝數變異(Copy Number Variations,CNVs)是指與參考基因組序列相比，所發生的長度在50bp到數Mb范圍內的變異，包括重復、缺失、插入、易位和衍生出的染色體結構變異，是影響動物表型多樣性和進化適應的主要因素之一，可通過多種機制對機體進行調節，如基因劑量和轉錄結構的改變。自首次構建出人類(Homo sapiens)基因組第一代CNV圖譜后，CNV在人類和動物中的研究越來越多。研究表明，CNV與動物的遺傳變異以及家畜的重要經濟特征有關。

對于已確定的CNV的檢測，通常是采用基于PCR技術和雜交技術的一些方法。例如QPCR、QMPSF、MLPA、FISH、Southern blotting和MAPH。其中，實時熒光定量PCR(QPCR)最為常用。根據QPCR所使用的熒光化學方法的不同，主要分為熒光染料嵌入法和熒光雜交探針法兩類。PCR反應體系中加入過量的SYBR Green染料分子后，當它結合到雙鏈DNA小溝部位時，會發出很強的熒光，在PCR延伸階段能夠被檢測到，具有較強的敏感性，相對于熒光探針類來說價格較低，因此被廣泛應用。通過對目的基因(具有拷貝數變異)及參考基因(無拷貝數變異)進行相對定量，根據2^-ΔΔCt方法統計檢測樣本候選基因的拷貝數。

VAMP7(Vesicle Associated Membrane Protein 7)基因一種蛋白質編碼基因，該蛋白是N-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體(SNARE)家族的成員。VAMP7蛋白定位于晚期內體和溶酶體，參與囊泡介導的轉運和網格蛋白衍生的囊泡出芽。目前揭示VAMP7的功能主要與鈣對溶酶體胞吐作用調節、嗜酸性粒細胞和嗜中性粒細胞的脫粒過程以及自然殺傷細胞殺死靶細胞有關。

云嶺牛是通過婆羅門牛(Brahman)、莫累灰(Murray Grey)和云南黃牛(YunnanYellow)雜交選育出來的肉用地方黃牛品種。目前，尚未見有關VAMP7基因CNV對云嶺牛生長性狀影響的文獻報道。

發明內容

本發明的目的在于提供一種檢測黃牛VAMP7基因CNV標記的方法及專用試劑盒，從而加快黃牛的選育進程。

為達到上述目的，本發明采用了以下技術方案：

一種檢測黃牛VAMP7基因CNV標記的方法，包括以下步驟：

以黃牛(例如，云嶺牛、夏南牛、皮南牛、郟縣紅牛)的血液全基因組DNA為模板，以引物對P1以及引物對P2為引物，分別通過實時熒光定量PCR擴增VAMP7基因的拷貝數變異區域以及作為內參的BTF3基因的部分片段，然后根據定量結果鑒定黃牛VAMP7基因的拷貝數變異類型；

所述的引物對P1為：