[發明專利]確定胞嘧啶修飾的方法

在審

• 申請號: 202010117568.7
• 申請日: 2020-02-25
• 公開（公告）號: CN113373207A
• 公開（公告）日: 2021-09-10
• 發明（設計）人: 唐沖;阮鳳英;石卓興;謝燁明;何映東;楊林峰
• 申請（專利權）人: 深圳華大基因科技服務有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 張立

本發明涉及一種確定胞嘧啶修飾的方法。該方法包括：對核酸樣品進行末端修復和加A處理，以便獲得末端修復產物；對所述末端修復產物進行糖基化反應，以便獲得糖基化產物；將所述糖基化產物與測序接頭連接，以便獲得連接產物；利用納米孔測序平臺對所述連接產物進行測序，以便確定所述核酸樣品中的胞嘧啶修飾；所述胞嘧啶修飾為5?羥甲基胞嘧啶修飾。所提供的方法反應條件溫和，不會對長片段DNA有較大損傷，可以實現5?羥甲基胞嘧啶修飾的直接檢測，尤其是長片段胞嘧啶修飾的檢測，在羥甲基分型領域有很大的應用前景。

技術領域

本發明涉及基因測序領域，具體涉及一種確定胞嘧啶修飾的方法。

背景技術

5-甲基胞嘧啶(5-methylated cytosine,5mC)和5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine,5hmC)是表觀修飾中較為常見的兩種修飾，與生命體內許多重要的生命活動密切相關，分別被稱為第五種堿基和第六種堿基。5mC發現較早，研究的比較透徹，研究結果表明5mC修飾與基因沉默、基因組印記及基因表達等密切相關。5hmC修飾，早先作為一種5mC去甲基化的中間產物而被發現，并未受到很大的關注。近年的研究表明，5hmC是一種重要的腫瘤篩查標志，在癌癥早篩及預后領域有很大的應用前景。然而當前市場上用于檢測5hmC和5mC修飾的方法都存在一定的不足。早先用于檢測5hmC修飾的標準方法大都基于亞硫酸氫鹽測序法做的改進，如oxBS-seq，TAB-seq測序法。亞硫酸鹽這種化學物質極具破壞性，投入的DNA中99％的會被降解，只適用于短讀長測序平臺，可應用的樣品范圍有限，此外這些方法還需要結合BS-seq的數據進行分析才能準確的定位5hmC和5mC修飾位點。也有研究者嘗試Pacbiao測序平臺檢測5hmC修飾，如hmC-seal，但對測序深度要求高，相應的測序成本也會提高，應用受到限制。Nanopore是近年來興起的一種單分子，實時測序技術，其測序原理與傳統的高通量測序技術完全不同，以單分子DNA(RNA)通過生物納米孔的電流變化推測堿基組成而進行測序，基于此原理，nanopore平臺在DNA的堿基修飾檢測上有很大的應用前景。

如何實現胞嘧啶修飾的檢測還需要進一步改進。

發明內容

本發明旨在至少在一定程度上解決相關技術中的技術問題之一。為此，本發明的一個目的在于提出一種確定胞嘧啶修飾的方法。

現有的用于檢測5hmC修飾的二代高通量測序技術，常用的有OxBS-seq技術(化學氧化結合重亞硫酸鹽測序技術)和TAB-seq技術。OxBS-seq技術首先通過將5hmC氧化為甲酰基修飾(5fC)，進而被重亞硫酸鹽處理轉換為U，從而排除5hmC的干擾，實現DNA甲基化的精準檢測。TAB-seq技術是對DNA樣品進行糖基化處理，特異性標記5hmC位點，使其轉化為β-葡糖基5-羥甲基胞嘧啶(5gmC)；然后對反應后的樣品進行氧化處理，將5mC氧化為5caC，而β-葡糖基5-羥甲基胞嘧啶則不會被氧化；再用亞硫酸氫鹽進行處理，將不含修飾的胞嘧啶轉化為尿嘧啶，將5caC轉化為caU，而β-葡糖基5-羥甲基胞嘧啶保留下來。經聚合酶鏈式反應后，只有原始的5hmC仍然保留為胞嘧啶，從而可以在單分子水平上檢測5hmC。然后這些技術大都基于亞硫酸氫鹽測序法進行改進，亞硫酸氫鹽極具破壞性，99％的DNA會被降解，10K長的基因組片段會被降解為1kb左右的片段，適用于短讀長測序平臺，應用有局限性。

三代平臺用于5hmC直接檢測也有相關技術發表，例如Hmc-seal技術。但是其是用在PacBio平臺檢測，存在測序深度要求高，存在成本高的問題。