[發明專利]一種檢測食管鱗癌癌組織與癌旁組織差異菌群的引物組、試劑盒和檢測方法

在審

• 申請號: 202010116480.3
• 申請日: 2020-02-25
• 公開（公告）號: CN111118187A
• 公開（公告）日: 2020-05-08
• 發明（設計）人: 胡志堅;林征;劉雙;相智聲;饒雯清
• 申請（專利權）人: 福建醫科大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6869;C12Q1/04;C12N15/11;G16B40/00
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 呂紀濤

本發明提供了一種檢測食管鱗癌癌組織與癌旁組織差異菌群的引物組、試劑盒和檢測方法，屬于微生物分子生物學檢測技術領域；所述引物組包括上游引物341F和下游引物806R。本發明以食管鱗癌癌組織與癌旁組織的基因組DNA為模板，利用所述引物組檢測兩種組織中的菌群，并通過統計分析，能夠檢測食管鱗癌癌組織與癌旁組織差異菌群，能夠解決現有方案使用口腔漱口水樣本檢測食管鱗癌差異菌存在特異性差，代表性不足的問題。另外，本發明的引物組能夠針對食管鱗癌癌組織與癌旁組織中所有細菌菌群進行檢測，能有效解決現有方案石蠟包埋方法只針對單一菌群檢測，代表性不足的問題。

技術領域

本發明涉及微生物分子生物學檢測技術領域，尤其涉及一種檢測食管鱗癌癌組織與癌旁組織差異菌群的引物組、試劑盒和檢測方法。

背景技術

食管癌是中國最常見的嚴重危害人民健康的惡性腫瘤之一，95％為食管鱗癌，具有惡性程度高、轉移快、術后生存質量差及明顯的區域發病率等特點。

目前關于食管鱗癌組織菌群差異分析的研究方法包括石蠟包埋檢測和口腔漱口水檢測；口腔漱口水檢測的檢測樣本來自口腔漱口水，特異性差，代表性不足；石蠟包埋檢測法使用的是石蠟包埋的組織，且涉及的病原菌單一，無法排除繼發關聯的可能性，檢測的代表性不足。目前缺少一種代表性好且結果可靠的檢測食管鱗癌癌組織與癌旁組織差異菌群的方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種檢測食管鱗癌癌組織與癌旁組織差異菌群的引物組、試劑盒和檢測方法，該引物組、試劑盒和檢測方法具有代表性好且結果可靠的優點。

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

本發明提供了一種檢測食管鱗癌癌組織與癌旁組織差異菌群的引物組，所述引物組包括上游引物341F和下游引物806R；所述上游引物341F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述下游引物806R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

本發明提供各類一種包括上述方案所述引物組的試劑盒。

優選的，所述試劑盒還包括2×Phusion Master Mix和雙蒸水。

本發明提供了一種基于上述方案所述引物組或所述試劑盒的非診斷目的的檢測食管鱗癌癌組織與癌旁組織差異菌群的方法，包括以下步驟：

1)分別提取食管鱗癌患者的癌組織和癌旁組織中的菌群基因組DNA；

2)分別以癌組織中的菌群基因組DNA和癌旁組織中的菌群基因組DNA 為模板，利用權利要求1所述引物組進行PCR擴增反應，得到PCR擴增產物；

3)對所述PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，選擇主帶大小在 400～450bp之間的條帶，切膠回收，得到目標條帶；

4)利用所述目標條帶構建文庫，進行測序，得到癌組織和癌旁組織菌群測序數據；

5)對所述癌組織和癌旁組織菌群測序數據進行質量控制，得到質控后的數據；

6)將所述質控后的數據導入Qiime2019.4軟件，使用DADA2算法降噪得到特異性擴增子，過濾總序列數低于10或出現在少于5例樣本中的特異性擴增子，應用Bayes分類器比對Greengenes13.8數據庫，對代表性特異性擴增子進行物種注釋，得到物種注釋后的數據；

7)采用Qiime2019.4軟件對物種注釋后的數據進行分析，分別計算癌組織和癌旁組織菌群的Alpha多樣性、Beta多樣性和相對豐度，得到計算結果；

8)統計計算結果，篩選得到食管鱗癌癌組織與癌旁組織的差異菌群。

優選的，所述上游引物341F和下游引物806R的濃度分別為10μmol/L。