[發(fā)明專利]一種檢測食管鱗癌癌組織與癌旁組織差異菌群的引物組、試劑盒和檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010116480.3
• 申請日: 2020-02-25
• 公開（公告）號: CN111118187A
• 公開（公告）日: 2020-05-08
• 發(fā)明（設計）人: 胡志堅;林征;劉雙;相智聲;饒雯清
• 申請（專利權(quán)）人: 福建醫(yī)科大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6869;C12Q1/04;C12N15/11;G16B40/00
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 呂紀濤

1.一種檢測食管鱗癌癌組織與癌旁組織差異菌群的引物組，所述引物組包括上游引物341F和下游引物806R；所述上游引物341F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述下游引物806R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.一種包括權(quán)利要求1所述引物組的試劑盒。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括2×Phusion MasterMix和雙蒸水。

4.一種基于權(quán)利要求1所述引物組或權(quán)利要求2或3所述試劑盒的非診斷目的的檢測食管鱗癌癌組織與癌旁組織差異菌群的方法，包括以下步驟：

1)分別提取食管鱗癌患者的癌組織和癌旁組織中的菌群基因組DNA；

2)分別以癌組織中的菌群基因組DNA和癌旁組織中的菌群基因組DNA為模板，利用權(quán)利要求1所述引物組進行PCR擴增反應，得到PCR擴增產(chǎn)物；

3)對所述PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，選擇主帶大小在400～450bp之間的條帶，切膠回收，得到目標條帶；

4)利用所述目標條帶構(gòu)建文庫，進行測序，得到癌組織和癌旁組織菌群測序數(shù)據(jù)；

5)對所述癌組織和癌旁組織菌群測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制，得到質(zhì)控后的數(shù)據(jù)；

6)將所述質(zhì)控后的數(shù)據(jù)導入Qiime2019.4軟件，使用DADA2算法降噪得到特異性擴增子，過濾總序列數(shù)低于10或出現(xiàn)在少于5例樣本中的特異性擴增子，應用分類器比對Greengenes13.8數(shù)據(jù)庫，對代表性特異性擴增子進行物種注釋，得到物種注釋后的數(shù)據(jù)；

7)采用Qiime2019.4軟件對物種注釋后的數(shù)據(jù)進行分析，分別計算癌組織和癌旁組織菌群的Alpha多樣性、Beta多樣性和相對豐度，得到計算結(jié)果；

8)統(tǒng)計計算結(jié)果，篩選得到食管鱗癌癌組織與癌旁組織的差異菌群。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟3)中所述PCR擴增反應的體系以30μL計包括：2×Phusion Master Mix 15μL、模板10μL、上游引物341F 1μL、下游引物806R 1μL和無菌雙蒸水3μL。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述上游引物341F和下游引物806R的濃度分別為10μmol/L。

7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟3)中所述PCR擴增反應的程序為：98℃、1min；98℃、10s，50℃、30s，72℃、30s，30個循環(huán)；72℃、5min。

8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟6)所述對所述癌組織和癌旁組織菌群測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制，包括以下步驟：

S1.去除所述癌組織和癌旁組織菌群測序數(shù)據(jù)的3’端引物接頭，根據(jù)PE reads之間的重復關系將成對的序列拼接成一條序列，得到第一樣品序列；

S2.通過標簽序列區(qū)分第一樣品序列，去除標簽序列、重疊區(qū)域出現(xiàn)兩個及以上錯配堿基、錯誤率高于1％、片段長度低于200bp的序列，得到第二樣品序列；

S3.去除第二樣品序列中的嵌合體，得到待分析的癌組織和癌旁組織菌群測序數(shù)據(jù)。