[發(fā)明專(zhuān)利]rhTSG-6雙抗體夾心ELISA法定量檢測(cè)試劑盒及其使用方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010116349.7
• 申請(qǐng)日: 2020-02-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111273029B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-03-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王明麗;周煒;何志遠(yuǎn);夏兵兵;吳博;蔣敏之
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 蕪湖天明生物技術(shù)有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): G01N33/68
• 分類(lèi)號(hào): G01N33/68;G01N33/58;G01N33/543
• 代理公司: 蕪湖安匯知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 34107
• 代理人: 尹婷婷

本發(fā)明公開(kāi)了rhTSG?6雙抗體夾心ELISA法定量檢測(cè)試劑盒及其使用方法和應(yīng)用，所述試劑盒包括包被有抗rhTSG?6多克隆抗體的酶標(biāo)板、酶標(biāo)記的抗rhTSG?6多克隆抗體、rhTSG?6蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、樣品稀釋液、洗滌液、顯色液A液、顯色液B液、終止液；通過(guò)抗原?抗體特異性反應(yīng)，以酶免疫技術(shù)為基礎(chǔ)，建立并研制了直接定量競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)發(fā)酵液、半成品、成品等及組織細(xì)胞樣本中rhTSG?6的方法學(xué)及可商品化試劑盒，可對(duì)相應(yīng)產(chǎn)品研制及對(duì)臨床樣品樣本進(jìn)行特異性檢測(cè)。本發(fā)明方法最低檢測(cè)限可達(dá)1.2ng/ml，批內(nèi)差異＜5％，批間差異＜10％；使用本發(fā)明方法對(duì)樣品中rhTSG?6定量檢測(cè)的回收率為在90％～110％之間，顯示該試劑盒對(duì)于生產(chǎn)企業(yè)進(jìn)行產(chǎn)品質(zhì)量控制及臨床標(biāo)本的檢測(cè)具有重要的商業(yè)開(kāi)發(fā)價(jià)值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種rhTSG-6雙抗體夾心ELISA法定量檢測(cè)試劑盒及其使用方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

腫瘤壞死因子α刺激基因6(tumor necrosis factor-αstimulated gene 6，TSG-6)是一種炎癥相關(guān)的分泌性蛋白，是由間充質(zhì)干細(xì)胞或基質(zhì)細(xì)胞(MSCs)對(duì)炎癥信號(hào)的反應(yīng)產(chǎn)生的，在多種炎癥性疾病或類(lèi)炎癥性病理過(guò)程中呈高表達(dá)?，F(xiàn)已知，TSG-6介導(dǎo)了許多免疫調(diào)節(jié)和組織修復(fù)過(guò)程，具有抗炎和組織保護(hù)作用，是一個(gè)正調(diào)節(jié)的功能蛋白。

大量研究表明，TSG-6蛋白具有抑制炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6等的表達(dá)、抑制中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)等功能，發(fā)揮較強(qiáng)的抗炎作用。隨著相關(guān)研究的進(jìn)展，TSG-6蛋白效力已逐漸被生物醫(yī)藥領(lǐng)域重視。但目前市場(chǎng)暫無(wú)相應(yīng)直接用于rhTSG-6產(chǎn)品和臨床標(biāo)本檢測(cè)的試劑盒。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)，重組人TSG-6(recombinant human TSG-6，rhTSG-6)在體內(nèi)外均具有抗病毒活性。并以此發(fā)現(xiàn)研制了rhTSG-6雙抗體夾心ELISA法定量檢測(cè)試劑盒，填補(bǔ)了此領(lǐng)域的空白。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種rhTSG-6雙抗體夾心ELISA法定量檢測(cè)試劑盒及其使用方法和應(yīng)用，其具有簡(jiǎn)便快速、成本低、特異性及靈敏性高等特點(diǎn)。

本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：

一種重組人腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白6雙抗體夾心ELISA法定量檢測(cè)試劑盒的研制，包括包被有抗rhTSG-6多克隆抗體的酶標(biāo)板、酶標(biāo)記的rhTSG-6抗多克隆抗體、rhTSG-6蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、樣品稀釋液、洗滌液、顯色液A液、顯色液B液、終止液。

進(jìn)一步地，抗rhTSG-6多克隆抗體為rhTSG-6重組抗原免疫Balb/c小鼠得到的抗血清經(jīng)多次純化后得到的精制抗體。

所述rhTSG-6重組抗原的基因序列如SEQUENCE LISTING 400〈2〉所示，其是通過(guò)對(duì)如SEQUENCE LISTING 400〈1〉所示的重組人TSG-6基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化獲得的，優(yōu)化前密碼子適應(yīng)指數(shù)(CAI)為0.73，優(yōu)化后CAI為0.97，通過(guò)密碼子優(yōu)化可實(shí)現(xiàn)重組人TSG-6抗原蛋白的高效表達(dá)，表達(dá)量達(dá)到30％以上。

所述rhTSG-6重組抗原的氨基酸序列如SEQUENCE LISTING 400〈3〉所示。

所述酶標(biāo)記抗rhTSG-6多克隆抗體為rhTSG-6重組抗原免疫Balb/c小鼠得到的抗血清經(jīng)親和層析法純化后采用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記。

所述包被有抗rhTSG-6多克隆抗體的酶標(biāo)板的制備方法為：將精制后的抗rhTSG-6多克隆抗體經(jīng)0.05M碳酸鹽緩沖液稀釋后包被酶標(biāo)板中，4℃過(guò)夜后，用pH 7.0內(nèi)含體積分?jǐn)?shù)為10％小牛血清的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液封閉封閉，洗滌拍干后裝入包裝袋抽真空保存。

所述rhTSG-6蛋白標(biāo)準(zhǔn)品為rhTSG-6重組抗原與凍干保護(hù)劑混合，經(jīng)冷凍干燥制備得到。