[發明專利]一種外源表達PPARγ對肝臟脂肪變性及脂質代謝相關基因影響的研究方法

在審

• 申請號: 202010116257.9
• 申請日: 2020-02-25
• 公開（公告）號: CN111304315A
• 公開（公告）日: 2020-06-19
• 發明（設計）人: 屈長青;白亮;岳少云;姬云濤;楊京霞;張碧瓊
• 申請（專利權）人: 阜陽師范大學
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883
• 代理公司: 合肥集知匠心知識產權代理事務所(普通合伙) 34173
• 代理人: 王麗麗

1.一種外源表達PPARγ對肝臟脂肪變性及脂質代謝相關基因影響的研究方法，其特征在于：

將實驗小鼠分成三組，分別尾靜脈注射LacZ腺病毒4d、PPARγ腺病毒2d、PPARγ腺病毒4d，處死后獲取肝臟組織；肝臟組織經過制作石蠟切片進行HE染色、制作冰凍切片進行油紅O染色、提取肝臟組織總RNA進行基因芯片分析；HE染色和油紅O染色后觀察肝臟脂肪病變程度；基因芯片分析用于篩選出外源性表達PPARγ引起肝臟中差異表達的基因。

2.根據權利要求1的研究方法，其特征在于，提取肝臟組織總RNA獲取基因芯片的方法為：

用Takara RNA試劑盒提取三組肝臟組織的總RNA，運用生物素標記RNA探針，然后與小鼠Illumina WG-6Bead Chip雜交，得到三組小鼠的全基因轉錄數據。

3.根據權利要求1的研究方法，其特征在于，基因芯片分析的方法為：

通過NCBI數據庫進行基因查找和比對，篩選出兩組PPARγ腺病毒注射組與LacZ腺病毒注射組的差異表達基因，然后用GO基因富集分析、Venn Diagram和HeatMap研究差異表達基因的分布，從而獲取差異基因的富集情況以及差異基因中的脂代謝相關基因的分布情況。

4.根據權利要求1的研究方法，其特征在于，還包括驗證基因芯片結果的過程，其方法為：選擇四個脂代謝差異表達基因為目的基因，以LacZ腺病毒注射組為對照組、PPARγ腺病毒4d注射組為實驗組，使用實時定量PCR驗證目的基因的表達情況，表達情況由mRNA相對豐度表示，目的基因的含量與內參基因含量比為目的基因的mRNA相對豐度；

其中，目的基因分別為PPARG、aP2、Lpin1和CideA；四個基因對應的引物分別為：

正向引物，5'-GGAAGACCACTCGCATTCCTT-3'；反向引物，5'-GTMTCAGCAACCATTGGGTCA-3'；

正向引物，5'-AAGGTGAAGAGCATCATAACCCT-3'；反向引物，5'-TCACGCCTTTCATAACACATTCC-3'；

正向引物，5'-CCTCCGCTCCCGAGAGAAA-3'；反向引物，5'-CGTTGTCTCCCAACTTCATGT-3'；

正向引物，5'-TGACATTCATGGGATTGCAGAC-3'；反向引物，5'-CATGGTTTGAAACTCGAAAAGGG-3'；

其中，內參基因為β-actin，其對應的引物為：

正向引物，5'-GTGACGTTGACATCCGTAAAGA-3'；反向引物，5’-CATGGTTTGAAACTCGAAAAGGG-3’。

5.根據權利要求1的研究方法，其特征在于，所述石蠟切片的制作方法為：

將肝臟組織經4％多聚甲醛固定后，按照以下步驟進行脫水：70％乙醇4h；80％乙醇2h；90％乙醇1h；95％乙醇2次，每次2h；100％乙醇2次，每次1h；二甲苯3次，每次1h；硬蠟2次，每次2h；脫水后石蠟包埋，切片即可。

6.根據權利要求1的研究方法，其特征在于，所述HE染色的方法為：

將石蠟切片按以下步驟脫蠟染色：二甲苯3次，每次7min；100％乙醇2次，每次1min；95％乙醇2次，每次1min；80％乙醇1min，70％乙醇1min，流水2min；蘇木素染色7min，流水沖洗5min；鹽酸乙醇分化15s，流水沖洗5min；伊紅染色5min，然后脫水和透明，即80％乙醇15s；95％乙醇2次，每次1min；100％乙醇2次，每次1min；二甲苯3次，每次3min；中性樹膠封片。

7.根據權利要求1的研究方法，其特征在于，所述冰凍切片的制作方法為：將肝臟組織進行OCT包埋，經冷凍切片機切片，置于-80℃冰箱儲藏。

8.根據權利要求1的研究方法，其特征在于：所述油紅O染色的方法為：

將冰凍切片復溫干燥10min，50％乙醇稍洗，浸入60％異丙醇溶解的油紅O染液10min，60％乙醇分化10s，流水沖洗2min,蘇木素復染2s，1％鹽酸乙醇分化15s，流水沖洗5min，甘油明膠封片。