[發明專利]一種外源表達PPARγ對肝臟脂肪變性及脂質代謝相關基因影響的研究方法

在審

• 申請號: 202010116257.9
• 申請日: 2020-02-25
• 公開（公告）號: CN111304315A
• 公開（公告）日: 2020-06-19
• 發明（設計）人: 屈長青;白亮;岳少云;姬云濤;楊京霞;張碧瓊
• 申請（專利權）人: 阜陽師范大學
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883
• 代理公司: 合肥集知匠心知識產權代理事務所(普通合伙) 34173
• 代理人: 王麗麗

本發明公開了一種外源表達PPARγ對肝臟脂肪變性及脂質代謝相關基因影響的研究方法。該方法包括以下步驟：將實驗小鼠分成三組，分別尾靜脈注射LacZ腺病毒4d、PPARγ腺病毒2d、PPARγ腺病毒4d，處死后獲取肝臟組織；肝臟組織經過制作石蠟切片進行HE染色、制作冰凍切片進行油紅O染色、提取肝臟組織總RNA進行基因芯片分析；HE染色和油紅O染色后觀察肝臟脂肪病變程度；基因芯片分析用于篩選出外源性表達PPARγ引起肝臟中差異表達的基因。該方法為PPARγ在肝臟中的作用和肝病的治療提供了一定的理論依據。

技術領域

本發明涉及脂質代謝領域，具體涉及一種外源表達PPARγ對肝臟脂肪變性及脂質代謝相關基因影響的研究方法。

背景技術

近年來，PPARγ在肝臟中的作用引起了人們的高度關注和廣泛研究。在生物信息學方面，已有學者基于RNA-Seq研究了PPARγ在許多動物模型及相關疾病中的作用機制，但外源性表達PPARγ對小鼠肝臟脂肪變性及脂質代謝基因表達的影響一直未見報道。目前，噻唑烷二酮類藥物(PPARγ激動劑)已被廣泛應用于臨床治療2型糖尿病、代謝綜合征、免疫性疾病等，但由于其所引起的水鈉潴留、骨質丟失以及心力衰竭風險，限制了PPARγ受體激動劑臨床普遍應用。隨著生物技術的發展，基因治療為臨床疾病診治帶來了新的曙光。研究外源表達PPAR對肝臟脂肪變性及脂質代謝基因表達的影響，具有十分重要的意義。

發明內容

本發明的目的是提供一種外源表達PPARγ對肝臟脂肪變性及脂質代謝相關基因影響的研究方法。

該研究方法的主要步驟為：

將實驗小鼠分成三組，分別尾靜脈注射LacZ腺病毒4d、PPARγ腺病毒2d、PPARγ腺病毒4d，處死后獲取肝臟組織；肝臟組織經過制作石蠟切片進行HE染色、制作冰凍切片進行油紅O染色、提取肝臟組織總RNA進行基因芯片分析；HE染色和油紅O染色后觀察肝臟脂肪病變程度；基因芯片分析用于篩選出外源性表達PPARγ引起肝臟中差異表達的基因。

其中，提取肝臟組織總RNA獲取基因芯片的方法為：用Takara RNA試劑盒提取三組肝臟組織的總RNA，運用生物素標記RNA探針，然后與小鼠Illumina WG-6Bead Chip雜交，得到三組小鼠的全基因轉錄數據。Takara RNA試劑盒的型號優選為D9108A。

其中，基因芯片分析的方法為：

通過NCBI數據庫進行基因查找和比對，篩選出兩組PPARγ腺病毒注射組與LacZ腺病毒注射組的差異表達基因，然后用GO基因富集分析、Venn Diagram(維恩圖)和HeatMap(熱圖)研究差異表達基因的分布，從而獲取差異基因的富集情況以及差異基因中的脂代謝相關基因的分布情況。

此外，該研究方法還包括驗證基因芯片結果的過程，其方法為：

選擇四個脂代謝差異表達基因為目的基因，以LacZ腺病毒注射組為對照組、PPARγ腺病毒4d注射組為實驗組，使用實時定量PCR驗證目的基因的表達情況，表達情況由mRNA相對豐度表示，目的基因的含量與內參基因含量比為目的基因的mRNA相對豐度；

其中，目的基因分別為PPARG、aP2、Lpin1和CideA；四個基因對應的引物分別為：

正向引物，5'-GGAAGACCACTCGCATTCCTT-3'；反向引物，5'-GTMTCAGCAACCATTGGGTCA-3'；

正向引物，5'-AAGGTGAAGAGCATCATAACCCT-3'；反向引物，5'-TCACGCCTTTCATAACACATTCC-3'；

正向引物，5'-CCTCCGCTCCCGAGAGAAA-3'；反向引物，5'-CGTTGTCTCCCAACTTCATGT-3'；