[發(fā)明專利]一種重組間充質(zhì)干細(xì)胞及其制備方法和在制備治療急性肝衰竭藥物的應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010116138.3
• 申請(qǐng)日: 2020-02-25
• 公開（公告）號(hào): CN111235115A
• 公開（公告）日: 2020-06-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 施曉雷;任昊楨;王經(jīng)琳;丁義濤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京鼓樓醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N5/10
• 分類號(hào): C12N5/10;C12N15/867;A61K35/28;A61P1/16
• 代理公司: 南京鐘山專利代理有限公司 32252
• 代理人: 劉佳慧

1.一種重組間充質(zhì)干細(xì)胞，其特征在于：

利用重組慢病毒感染間充質(zhì)干細(xì)胞獲得；

其中，所述重組慢病毒由過表達(dá)PTGS2的重組質(zhì)粒和慢病毒包裝載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后獲得；

所述過表達(dá)PTGS2的重組質(zhì)粒由擴(kuò)增PTGS2前引物序列和后引物序列、以及空質(zhì)粒載體Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin制得。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，其特征在于：

包括以下步驟：

步驟一、間充質(zhì)干細(xì)胞的分離；

步驟二、由擴(kuò)增PTGS2前引物序列和后引物序列、以及空質(zhì)粒載體Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin制得過表達(dá)PTGS2的重組質(zhì)粒；

步驟三、所述過表達(dá)PTGS2的重組質(zhì)粒和慢病毒包裝載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后獲得所述重組慢病毒；

步驟四、所述重組慢病毒感染所述間充質(zhì)干細(xì)胞。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，其特征在于：

其中，步驟二的具體方法為：

利用前引物序列和后引物序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增片段；

所述空質(zhì)粒載體Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin用BamHI/AgeI于37℃進(jìn)行酶切反應(yīng)，收回酶切產(chǎn)物；

將所述PCR擴(kuò)增片段和酶切產(chǎn)物進(jìn)行交換反應(yīng)，然后冷卻轉(zhuǎn)化，獲得所述過表達(dá)PTGS2的重組質(zhì)粒。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，其特征在于：

其中，所述前引物序列為如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，后引物序列為如SEQ IDNo.2所示的核苷酸序列；

所述PCR擴(kuò)增條件如下：

98℃，5min；

98℃ 10Ses，55℃ 10Ses，72℃ 90Ses，共30個(gè)循環(huán)；

72℃，8min；

4℃，∞。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，其特征在于：

其中，所述酶切反應(yīng)條件為：配置50uL酶切體系，于37℃反應(yīng)3h；

所述酶切體系為ddH₂O 41uL、10×CutSmart Buffer² 5uL、空質(zhì)粒載體DNA 2uL、Age I1uL、BamHI 1uL；

所述空質(zhì)粒載體DNA為1ug/uL；

所述Age I為10U/μl；

所述BamHI為10U/μl。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，其特征在于：

其中，所述交換反應(yīng)條件為：10uL反應(yīng)體系，37℃反應(yīng)30min；

所述反應(yīng)體系為ddH₂O 2.5uL、5×CE Ⅱ Buffer 2uL、酶切產(chǎn)物目的基因片段2.5uL、PCR擴(kuò)增片段2uL、Exnase^TM Ⅱ 1uL；

進(jìn)行交換反應(yīng)后置于冰水浴中冷卻5min后立即轉(zhuǎn)化；

所述轉(zhuǎn)化的具體操作為將10μL交換反應(yīng)產(chǎn)物加入到100μL DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈管壁數(shù)下混勻，在冰上放置30min，然后42℃熱激90s，冰水浴孵育2min，再加入500μL LB培養(yǎng)基，37℃過夜，獲得所述過表達(dá)PTGS2的重組質(zhì)粒。

7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，其特征在于：

其中，步驟三中，所述過表達(dá)PTGS2的重組質(zhì)粒與慢病毒包裝載體一起轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒的包裝，獲得所述重組慢病毒。

8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，其特征在于：

其中，所述慢病毒包裝載體為pHelper 1.0載體質(zhì)粒、pHelper 2.0載體質(zhì)粒。