[發明專利]一種肺炎克雷伯桿菌噬菌體抑制小鼠乳腺炎模型建立方法

有效

• 申請號: 202010116031.9
• 申請日: 2020-02-25
• 公開（公告）號: CN111387133B
• 公開（公告）日: 2021-04-16
• 發明（設計）人: 韓博;石玉祥;高健;趙文鵬;劉鋼;劉洋;張永英;朱陣
• 申請（專利權）人: 中國農業大學;河北工程大學
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851
• 代理公司: 北京集智東方知識產權代理有限公司 11578
• 代理人: 吳倩

本發明提供了一種肺炎克雷伯桿菌噬菌體抑制小鼠乳腺炎模型建立方法，包括如下步驟：A、肺炎克雷伯桿菌菌液制備、B、肺炎克雷伯桿菌噬菌體培養液制備、C、實驗動物處理、D、實驗樣品的采集及檢測。本發明通過此方法可更精準的找到針對小鼠乳腺炎的裂解譜寬、裂菌能力強、無毒副作用的肺炎克雷伯桿菌噬菌體，為治療牛乳腺炎提供實驗和理論依據。

技術領域

本發明屬于生物醫藥領域，具體涉及一種肺炎克雷伯桿菌噬菌體抑制小鼠乳腺炎模型建立方法。

背景技術

肺炎克雷伯桿菌作為一種環境性致病菌，通常在養殖場的墊料、污水、動物體外以及糞便中分離到。肺炎克雷伯桿菌引發的奶牛乳房炎通常發生在奶牛泌乳期，在此期間感染該菌不但造成產奶量降低、奶品質下降，嚴重的還造成奶牛急性死亡。目前，肺炎克雷伯桿菌引發的奶牛乳房炎主要采用抗生素進行治療，但此種療法往往存在預后不佳、反復發作，且易造成嚴重的耐藥性。

該菌對奶牛場造成的經濟損失不亞于革蘭氏陽性菌引發乳房炎所造成的經濟損失。在我國大型奶牛養殖場中，由肺炎克雷伯桿菌引發的奶牛乳房炎占比較高。對我國21個省市161家大型牧場的3288份臨床乳房炎奶樣進行病原菌的分離鑒定，結果顯示克雷伯氏菌的檢出率(13.0％)位居第二，僅次于大腸桿菌(14.4％)。而國外的克雷伯桿菌(14.3％)檢出率位居革蘭氏陰性菌的榜首。由此可見，肺炎克雷伯桿菌在奶牛場的檢出率居高不下，這是導致奶牛場中奶牛乳房炎頻發的主要原因之一。

現有治療奶牛乳房炎的方法大多采用抗生素等療法，肉和奶產品易產生藥物殘留且致病菌容易產生抗藥性及危害生態環境。偶見有關于肺炎克雷伯桿菌噬菌體治療乳腺炎報道，但傳統的肺炎克雷伯桿菌噬菌體裂解譜窄、裂菌能力低且對牛乳腺上皮細胞有一定的毒害作用，難以推廣使用。

發明內容

本發明為解決現有技術短缺的問題，本發明提供了一種肺炎克雷伯桿菌噬菌體抑制小鼠乳腺炎模型建立的方法，旨在找到針對小鼠乳腺炎的裂解譜寬、裂菌能力強、無毒副作用的肺炎克雷伯桿菌噬菌體，為治療牛乳腺炎提供實驗和理論依據。

本發明采用的技術方案為：一種肺炎克雷伯桿菌噬菌體抑制小鼠乳腺炎模型建立方法，包括如下步驟：

A、肺炎克雷伯桿菌菌液制備:

將肺炎克雷伯桿菌劃線接種至LB固體培養基，置于37℃恒溫培養箱，過夜培養；再挑取單個菌落，接種于BHI液體培養基，置于37℃220r/min搖床，過夜培養，將菌液濃度調至不同濃度，備用；

B、肺炎克雷伯桿菌噬菌體培養液制備：

用SM溶液梯度稀釋噬菌體懸液，取相同梯度稀釋液與A步驟的肺炎克雷伯桿菌菌液按照體積比1：1充分混勻；將上述混合液加入至LB半固體培養基，快速充分混勻后，立即將之倒入到鋪有LB固體培養基的培養皿上，待其凝固后，37℃倒置2-4h，觀察噬菌斑生長情況；根據噬菌體的效價，用SM溶液稀釋，備用；

C、實驗動物處理：

健康雌性Balb/C懷孕小鼠，飼喂標準日糧，自由飲水；懷孕小鼠產仔泌乳7天后進行試驗；開始試驗操作前1h，將仔鼠與小鼠分開，麻醉；將小鼠固定并用75％酒精對第4對乳頭消毒，在體式顯微鏡下，用微量注射器通過小鼠乳頭乳導管接種，注射完畢后將小鼠放入籠內，待其完全清醒后放到動物房內進行飼養；

D、實驗樣品的采集及檢測：

上述多只小鼠分別在接菌后第12h、24h和36h時，通過麻醉處死后，浸泡在75％酒精中2min，無菌采集第4對乳腺組織；將采集的部分乳腺組織固定在4％多聚甲醛中，用于病理切片的制作；將剩余乳腺組織分別保存在液氮和滅菌PBS溶液中，分別用于檢測；

E、所述D步驟中檢測內容包括：小鼠乳腺組織形態學觀察、小鼠乳腺組織內肺炎克雷伯桿菌、細胞因子、炎性因子和凋亡基因mRNA表達水平檢測以及免疫組化觀察。