[發明專利]一種肺炎克雷伯桿菌噬菌體抑制小鼠乳腺炎模型建立方法

有效

• 申請號: 202010116031.9
• 申請日: 2020-02-25
• 公開（公告）號: CN111387133B
• 公開（公告）日: 2021-04-16
• 發明（設計）人: 韓博;石玉祥;高健;趙文鵬;劉鋼;劉洋;張永英;朱陣
• 申請（專利權）人: 中國農業大學;河北工程大學
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851
• 代理公司: 北京集智東方知識產權代理有限公司 11578
• 代理人: 吳倩

1.一種肺炎克雷伯桿菌噬菌體抑制小鼠乳腺炎模型建立方法，其特征在于：包括如下步驟：

A、肺炎克雷伯桿菌菌液制備：

將肺炎克雷伯桿菌劃線接種至LB固體培養基，置于37℃恒溫培養箱，過夜培養；再挑取單個菌落，接種于BHI液體培養基，置于37 ℃ 220 r/min搖床，過夜培養，將菌液濃度調至不同濃度，備用；

B、肺炎克雷伯桿菌噬菌體培養液制備：

用SM溶液梯度稀釋噬菌體懸液，取相同梯度稀釋液與A步驟的肺炎克雷伯桿菌菌液按照體積比1：1充分混勻；將上述混合液加入至LB半固體培養基，快速充分混勻后，立即將之倒入到鋪有LB固體培養基的培養皿上，待其凝固后，37℃倒置2-4 h，觀察噬菌斑生長情況；根據噬菌體的效價，用SM 溶液稀釋，備用；

C、實驗動物處理：

健康雌性Balb/C懷孕小鼠，飼喂標準日糧，自由飲水；懷孕小鼠產仔泌乳7天后進行試驗；開始試驗操作前1 h，將仔鼠與小鼠分開，麻醉；將小鼠固定并用75%酒精對第4對乳頭消毒，在體式顯微鏡下，用微量注射器通過小鼠乳頭乳導管接種肺炎克雷伯桿菌和肺炎克雷伯桿菌噬菌體，注射完畢后將小鼠放入籠內，待其完全清醒后放到動物房內進行飼養；

D、實驗樣品的采集及檢測：

上述多只小鼠分別在接種后第12 h、24 h 和36 h時，通過麻醉處死后，浸泡在75% 酒精中2 min，無菌采集第4對乳腺組織；將采集的部分乳腺組織固定在4%多聚甲醛中，用于病理切片的制作；將剩余乳腺組織分別保存在液氮和滅菌PBS溶液中，分別用于檢測；

E、所述D步驟中檢測內容包括：小鼠乳腺組織形態學觀察、小鼠乳腺組織內肺炎克雷伯桿菌、細胞因子、炎性因子和凋亡基因 mRNA表達水平檢測以及免疫組化觀察。

2.根據權利要求1所述一種肺炎克雷伯桿菌噬菌體抑制小鼠乳腺炎模型建立方法，其特征在于：所述E步驟中小鼠乳腺組織內肺炎克雷伯桿菌含量檢測的方法具體為：無菌采取乳腺組織，置于組織勻漿儀，并加入生理鹽水，其中乳腺組織與生理鹽水的質量比為1：1；充分勻漿，再用滅菌生理鹽水10倍倍比稀釋組織勻漿，采用選擇培養基進行涂板，37 ℃倒置培養過夜，統計并計算乳腺組織內的細菌含量。

3.根據權利要求1所述一種肺炎克雷伯桿菌噬菌體抑制小鼠乳腺炎模型建立方法，其特征在于：所述E步驟中小鼠乳腺組織中細胞因子含量測定的方法具體為：將采集的小鼠乳腺組織置于組織勻漿儀充分勻漿，4 ^oC，12 000 r/min離心10 min，收集上清液備用；利用ELISA試劑盒檢測小鼠乳腺組織研磨上清液TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8和CXCL2 細胞因子含量。

4.根據權利要求1所述一種肺炎克雷伯桿菌噬菌體抑制小鼠乳腺炎模型建立方法，其特征在于：所述E步驟中小鼠乳腺組織形態學觀察為：將固定的小鼠乳腺組織進行整修，脫水和石蠟包埋，經石蠟切片機切成厚度為1~7μm的切片，經展片和烤片之后，對組織切片采用二甲苯脫蠟和不同系列濃度的酒精脫水，然后經伊紅和蘇木精進行染色后，采用中性樹膠進行封片，在光學顯微鏡下觀察乳腺組織形態學變化并采集照片。