[發明專利]一種雙細胞粘附耦合法生產戊二酸的方法

在審

• 申請號: 202010115707.2
• 申請日: 2020-02-25
• 公開（公告）號: CN111304263A
• 公開（公告）日: 2020-06-19
• 發明（設計）人: 陳可泉;王昕;許晟
• 申請（專利權）人: 南京凱諾生物科技有限公司
• 主分類號: C12P7/44
• 分類號: C12P7/44;C12R1/19
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務所 32237
• 代理人: 胡建華

本發明公開了一種雙細胞粘附耦合法生產戊二酸的方法，其包括如下步驟：(1)用PBS緩沖液將重組菌株E.coli BL?22AB菌泥重懸，再加入表面活性劑，攪拌；(2)將步驟(1)得到的物料與多巴胺溶液混合，攪拌，再向其中加入甘露糖溶液，攪拌，離心，得到菌泥；(3)用PBS緩沖液將重組菌E.coli BL?YDT菌泥重懸，得到細胞溶液A；用PBS緩沖液將步驟(2)得到的菌泥重懸，得到細胞溶液B；將細胞溶液A與細胞溶液B混合，攪拌，加入多巴胺溶液，攪拌，離心，得到耦合粘附菌泥；(4)用PBS緩沖液將耦合粘附菌泥重懸，再加入L?賴氨酸溶液和α?酮戊二酸溶液，反應，離心，即得。

技術領域

本發明屬于微生物細胞催化、戊二酸生產技術領域，具體涉及一種雙細胞粘附耦合法生產戊二酸的方法。

背景技術

戊二酸是一種重要的碳五平臺化學品，在聚酰胺材料領域具有廣泛用途，還可以用作增塑劑、腐蝕抑制劑、剛柔性鑭系配位聚合物等材料領域。化學合成戊二酸的過程存在原料昂貴、污染嚴重、轉化率低等問題，生物合成戊二酸近年來受到廣泛關注。在微生物體內，戊二酸可由L-賴氨酸經5-氨基戊酸(5-AMV)途徑分解代謝產生。全細胞催化L-賴氨酸合成戊二酸過程中中間代謝產物5-氨基戊酸積累嚴重，生產效率低下等問題，通過建立基于兩個重組菌株(E.coli BL21-22AB和E.coli BL21-YDT)的雙細胞耦合催化體系，優化蛋白表達，強化催化過程，分批補料解決底物抑制等手段，提高了戊二酸的產量。雙細胞耦合的全細胞催化體系，降低了中間產物積累和多基因共表達相互影響；并進一步通過表達L-谷氨酸氧化酶催化L-谷氨酸合成α-酮戊二酸，構建全細胞催化共底物α-酮戊二酸的循環再生系統，降低過程成本，為戊二酸的高效生物合成提供指導。

然而在實際的應用過程中，兩種細胞之間的耦合作用依靠分細胞泌物溶解在反應介質中進行傳質，因此提高雙細胞耦合作用的關鍵難點在于提高兩種細胞之間的傳質效率。目前，多種聚合物涂層已有報道在黏附微生物上進行很好的附著，其次基于蛋白與多糖之間的特異性吸附原理，本發明開發了一種雙細胞的黏附耦合技術，直接將兩種細胞黏附在一起，降低了反應物質的傳質距離。雙細胞黏附耦合技術在提高兩種細胞之間的傳質效率的同時，提高了雙細胞的耐受性，最終提升了戊二酸的產量。

發明內容

發明目的：本發明所要解決的技術問題是針對現有技術中雙細胞耦合作用時，兩種細胞之間的傳質效率低導致的催化效果差，提供一種雙細胞粘附耦合法生產戊二酸的方法，該方法對于戊二酸的產量有了明顯的提升，并且顯著提升了雙細胞生物催化劑的使用性能。

為了解決上述技術問題，本發明公開了一種雙細胞粘附耦合法生產戊二酸的方法，在收集的第一種微生物細胞懸液中添加表面活性劑，提高微生物細胞細胞膜的通透性后，除去表面活性劑溶液，添加聚合物和甘露糖，即得到細胞膜通透性增加且具有吸附/粘性涂層的第一種微生物細胞。而后與第二種微生物細胞混合，兩種微生物細胞發生黏附作用后，繼續添加聚合物，提高黏附效果，最終得到兩種細胞黏附耦合的生物催化劑。這種雙細胞黏附耦合技術，降低了兩種細胞之間的物質傳質距離，提升生物催化過程中的耐受性，最終提升戊二酸的產量；其中雙細胞黏附過程使用到的聚合物為多巴胺(多巴胺聚合物生物親和性高且便宜)自聚合生成的聚多巴胺。一般來說，加入表面活性劑即導致細胞膜通透性提升、細胞耐受性下降，不利于細胞長時間催化，固本發明采用聚多巴胺進行修飾。

具體的，其包括如下步驟：

(1)將重組菌株E.coli BL-22AB和重組菌株E.coli BL-YDT分別進行培養，離心，得到重組菌株E.coli BL-22AB菌泥和重組菌株E.coli BL-YDT菌泥；

(2)用PBS緩沖液將步驟(1)得到的重組菌株E.coli BL-22AB菌泥重懸，得到重懸液；向重懸液中加入表面活性劑，攪拌，得到通透性增加的重組菌株E.coli BL-22AB細胞溶液；