[發(fā)明專利]一種雙細胞粘附耦合法生產(chǎn)戊二酸的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202010115707.2
• 申請日: 2020-02-25
• 公開（公告）號: CN111304263A
• 公開（公告）日: 2020-06-19
• 發(fā)明（設計）人: 陳可泉;王昕;許晟
• 申請（專利權）人: 南京凱諾生物科技有限公司
• 主分類號: C12P7/44
• 分類號: C12P7/44;C12R1/19
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務所 32237
• 代理人: 胡建華

1.一種雙細胞粘附耦合法生產(chǎn)戊二酸的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)將重組菌株E.coli BL-22AB和重組菌株E.coli BL-YDT分別進行培養(yǎng)，離心，得到重組菌株E.coli BL-22AB菌泥和重組菌株E.coli BL-YDT菌泥；

(2)用PBS緩沖液將步驟(1)得到的重組菌株E.coli BL-22AB菌泥重懸，得到重懸液；向重懸液中加入表面活性劑，攪拌，得到通透性增加的重組菌株E.coli BL-22AB細胞溶液；

(3)將步驟(2)得到的通透性增加的重組菌株E.coli BL-22AB細胞溶液中與多巴胺溶液混合，一次攪拌，再向其中加入甘露糖溶液，二次攪拌，離心，得到通透性修飾后具有表面粘附涂層的重組菌株E.coli BL-22AB菌泥；

(4)用PBS緩沖液將步驟(1)得到的重組菌E.coliBL-YDT菌泥重懸，得到細胞溶液A；用PBS緩沖液將步驟(3)得到的通透性修飾后具有表面粘附涂層的重組菌株E.coli BL-22AB菌泥重懸，得到細胞溶液B；將細胞溶液A與細胞溶液B混合，一次攪拌，加入多巴胺溶液，二次攪拌，離心，得到耦合粘附菌泥；

(5)用PBS緩沖液將步驟(4)得到的耦合粘附菌泥重懸，得到重懸液；向重懸液中加入L-賴氨酸溶液和α-酮戊二酸溶液，催化反應，離心，所得上清液即為含有戊二酸的液體。

2.根據(jù)權利要求1所述的雙細胞粘附耦合法生產(chǎn)戊二酸的方法，其特征在于，步驟(2)中，用PBS緩沖液將步驟(1)得到的重組菌株E.coliBL-22AB菌泥重懸至OD₆₀₀為1～10。

3.根據(jù)權利要求1所述的雙細胞粘附耦合法生產(chǎn)戊二酸的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述的表面活性劑為吐溫類表面活性劑、司班類表面活性劑、曲拉通X-100中的任意一種；控制表面活性劑的添加量，使表面活性劑的體積濃度為0.5％～2％。

4.根據(jù)權利要求1所述的雙細胞粘附耦合法生產(chǎn)戊二酸的方法，其特征在于，步驟(3)中，多巴胺溶液中多巴胺的濃度為0.1～2.5g/L，多巴胺溶液的溶劑為pH 7.5Tris-HCl緩沖液；步驟(2)得到的通透性增加的重組菌株E.coli BL-22AB細胞溶液與多巴胺溶液的體積比為1:1～1:3。

5.根據(jù)權利要求1所述的雙細胞粘附耦合法生產(chǎn)戊二酸的方法，其特征在于，步驟(3)中，所述的甘露糖溶液中甘露糖的濃度為0.5～3g/L，甘露糖溶液的溶劑為水；甘露糖溶液與多巴胺溶液的體積比為1:1～1:5。

6.根據(jù)權利要求1所述的雙細胞粘附耦合法生產(chǎn)戊二酸的方法，其特征在于，步驟(4)中，細胞溶液A的OD₆₀₀為2～10；細胞溶液B的OD₆₀₀為5～10；多巴胺溶液中多巴胺的濃度為0.1～2.5g/L，多巴胺溶液的溶劑為pH 7.5Tris-HCl緩沖液。

7.根據(jù)權利要求1所述的雙細胞粘附耦合法生產(chǎn)戊二酸的方法，其特征在于，步驟(4)中，細胞溶液A與細胞溶液B按照體積比為1:1混合；多巴胺溶液與細胞溶液A的體積比為1:1～1:3。

8.根據(jù)權利要求1所述的雙細胞粘附耦合法生產(chǎn)戊二酸的方法，其特征在于，步驟(5)中，用PBS緩沖液將步驟(4)得到的耦合粘附菌泥重懸至體系中E.coli BL-22AB和E.coliBL-YDT的細胞溶液濃度均為OD₆₀₀＝5～10。

9.根據(jù)權利要求1所述的雙細胞粘附耦合法生產(chǎn)戊二酸的方法，其特征在于，步驟(5)中，所述L-賴氨酸溶液和α-酮戊二酸溶液的pH值均為7.0，溶劑為PBS緩沖液；控制L-賴氨酸溶液和α-酮戊二酸溶液的添加量，使體系中L-賴氨酸和α-酮戊二酸的終濃度均為10～60g/L。

10.根據(jù)權利要求1所述的雙細胞粘附耦合法生產(chǎn)戊二酸的方法，其特征在于，步驟(5)中，所述的催化反應為在37℃下反應30～60h。