[發明專利]定量檢測蒼白桿菌的聚合酶鏈式反應引物、試劑盒和定量檢測蒼白桿菌的方法

在審

• 申請號: 202010114190.5
• 申請日: 2020-02-25
• 公開（公告）號: CN111254208A
• 公開（公告）日: 2020-06-09
• 發明（設計）人: 黃婕;吉鴻睿;金龍;史宏偉;張治洲
• 申請（專利權）人: 威海以琳生物制品有限公司;哈爾濱工業大學（威海）
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6851;C12Q1/06;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 北京化育知識產權代理有限公司 11833
• 代理人: 尹均利

本發明提供了檢測蒼白桿菌的一對引物，可以快速對任意可能含有蒼白桿菌的菌群樣本進行測定，對蒼白桿菌實現特異性識別。本發明提供的方法將待測樣本的宏基因組提取出來并稀釋分裝以后,各自取出少量稀釋的宏基因組樣本等量混合后使用一對引物進行擴增，擴增產物經過濃度測定作為QPCR定量標準原液，之后對全部樣本進行蒼白桿菌的定量測定。采用本發明提供的引物對對蒼白桿菌進行檢測，能夠避免其他具有高度相似核糖體RNA基因片段菌種的干擾，實現對蒼白桿菌的準確測定。

技術領域

本申請涉及生物檢測及微生物技術領域，尤其涉及一種定量檢測蒼白桿菌的聚合酶鏈式反應引物、試劑盒和定量檢測蒼白桿菌的方法。

背景技術

蒼白桿菌是一種具平行邊和圓端的桿菌，通常單個出現；細胞染色為革蘭氏陰性；通過周生鞭毛運動；是一類專性好氧，嚴格呼吸代謝，以氧為末端電子受體，能利用各種氨基酸、有機酸和碳水化合物為碳源的菌群；最適生長溫度為20～37℃；在營養瓊脂上的菌落無色；在低溫環境下，生長過程中可產生多種纖維素酶，用于分解玉米秸稈等農作物，從而改善土壤理化性質，提高土壤肥力。蒼白桿菌發酵液的乳化指數較高，具有較強的乳化作用，代謝降解飽和烴和芳香烴，降低原油中的飽和烴以及輕質組分，改善原油物性，有效降解石油烴；并為其進一步應用于現場驅油試驗以及石油污染土壤等修復領域提供可能。已經有大量研究資料表明蒼白桿菌還能夠降解一批范圍廣泛的工農業常見有機污染物或殘留物，例如甲苯、對二甲苯、1,2-二氯苯，苯胺，正己烷，十二烷基苯磺酸鈉，草甘膦，芘類物質，多環芳烴，某些芳香族化合物(如酚類，苯環化合物)精喹禾靈，多菌靈，強力霉素，萘，菲，阿維菌素，吡蟲啉殺蟲劑，甲基對硫磷，百菌清，氯嘧磺隆,氟氯氰菊酯,撲草凈,硫化氫,硫丹,二苯并噻吩,串珠鐮刀菌素等。因此，蒼白桿菌的研究對于人類生產生活環境尤其是環境治理具有重要意義。

但是關于蒼白桿菌的特異性檢測技術尤其是在分子水平上的檢測技術鮮有報道。蒼白桿菌的基因組測序進展也不大，目前在歐洲基因組網站數據庫(EBI genome)中只看到蒼白桿菌(Ochrobactrum anthropi)的兩個染色體基因組序列(OchrobactrumanthropiATCC 49188chromosome 1，2,887,297堿基，編號CP000758；OchrobactrumanthropiATCC 49188chromosome 2，1,895,911堿基，編號CP000759)。鑒于蒼白桿菌能夠降解或參與范圍降解如此廣泛的各種殺蟲劑、農殘及工業污廢產物，加快研制蒼白桿菌的特異性檢測技術非常有必要。

目前非常缺乏對蒼白桿菌的快速檢測方法。目前一般是使用一定的培養基培養樣本中的菌屬，菌落生長出來以后提取菌落基因組DNA進行核糖體RNA基因的擴增和測序，繼而判斷是否屬于蒼白桿菌。但是基于核糖體RNA基因的判斷方法有時會出現差錯，原因是有些菌種的分類差異很大但是卻有高度相似的核糖體RNA基因片段；也有使用BIOLOG方法來進行蒼白桿菌的檢測，但是速度較慢，對應的成本也比較高(J Environ Sci(China).2009；21(10):1446-51.Isolation ofmarine benzo[a]pyrene-degrading Ochrobactrumsp.BAP5 andproteins characterization)。

發明內容

本發明的目的在于提供一種定量檢測蒼白桿菌的聚合酶鏈式反應引物對，能夠實現對蒼白桿菌的特異性檢測。

本發明提供了一種定量檢測蒼白桿菌的聚合酶鏈式反應引物對，包括上游引物和下游引物，所述上游引物具有如OA3F所示核苷酸序列，所述下游引物具有如OA3R所示核苷酸序列：

OA3F:5'-CAACGGGAACCAGTCGAAGAACGAGCCGCC-3'

OA3R:5'-TCAAGGAAAAGATGCCGGTTTCAATCTCGC-3'。