[發明專利]基于lacZ基因和pUC復制子的原核啟動子報告系統及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 202010113295.9
• 申請日: 2020-02-24
• 公開（公告）號: CN111235172B
• 公開（公告）日: 2021-10-19
• 發明（設計）人: 付立霞;徐敬瀟;楊輝;黃志斌;龔建森;韓先干
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/65;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 王艷

本發明公開基于lacZ基因和pUC復制子的原核啟動子報告系統，該報告系統包括源自pFLX107的pUC復制子，Cat基因，rrnbT1T2，lambda t0轉錄終止子，源自質粒pRCL且內部ClaI、SacI和NdeI位點被沉默突變的lacZ基因。本發明還公開原核啟動子報告系統的構建方法及應用。本發明構建的質粒pFGH06大小為4949bp，28℃培養條件下的背景活性僅為12.2±0.6，極顯著低于低拷貝參考質粒pRCL的背景活性21.3±1.7，并應用于誘導型啟動子araBAD和組成型啟動子rpsM的克隆及活性測定，在模擬應用于啟動子篩選時，可通過藍白斑篩選實現對目標啟動子的100%識別。

技術領域

本發明屬于生物工程領域，具體涉及基于lacZ基因和pUC復制子的原核啟動子報告系統及其構建方法和應用。

背景技術

原核啟動子是位于基因上游的一段能被RNA聚合酶識別、結合并起始轉錄的特定DNA序列，其主要功能是控制基因表達的強度及模式，是基因轉錄水平調控的中心，因此對啟動子進行準確的識別與鑒定是研究分析基因功能及其調控機制的前提和基礎，對于為實現特定實驗目的而進行的相關基因工程載體構建和突變菌株改造亦具有著十分重要的意義。

隨著越來越多細菌和病毒基因組序列被測定并發布，以及生物信息學的發展，對啟動子的識別可借助于各種基于不同算法的軟件模型進行預測，但最終的驗證或鑒定仍需通過報告基因系統來完成。迄今，已報道的可用于啟動子篩選及活性測定的報告基因有氯霉素乙酰基轉移酶、綠色熒光蛋白、熒光素酶和β-半乳糖苷酶等，其中由lacZ基因編碼的β-半乳糖苷酶廣泛存在于多種生物中，能水解乳糖為半乳糖和葡萄糖，也具有轉移半乳糖苷的作用，可將乳糖轉變為異乳糖，而后者是乳糖操縱子的誘導物，在細菌的代謝過程中有著非常重要的作用。此外，β-半乳糖苷酶性質穩定，在多種生物體中均能正確表達和折疊，能使多種底物顯色，具有多樣化的讀出過程，可比較方便地進行定量檢測，這些優點使得lacZ自上世紀60年代末被分離以來就成為基因工程實驗中最常用、最成熟的一種報告基因。

然而，當前市場上銷售的各類啟動子報告系統主要針對真核生物細胞，尚未見商品化的原核啟動子報告系統，當前基于lacZ的原核啟動子報告系統多為低拷貝的穿梭載體，體積較大，不便于啟動子克隆時重組質粒的構建，理論上還會降低對弱啟動子的檢測靈敏度。此外，這些載體中緊鄰lacZ基因上游的啟動子探測區域克隆位點也普遍偏少，也不便于序列中含有相同酶切位點的啟動子克隆；最后，部分報告系統所用宿主菌并非lacZ缺失突變株，潛在的背景活性也會干擾測定結果。這些問題的存在都會制約啟動子報告系統的實際應用，不利于商業化推廣，有待進一步改進或完善。

發明內容

發明目的：本發明的目的在于降低原核啟動子報告系統在實際應用時的設計和實驗操作成本，本發明在保留傳統lacZ報告系統應用優勢的同時克服了其技術缺陷，具有體積小，克隆位點多，背景活性可調，同時提高其對原核啟動子的識別篩選效率，在用于原核啟動子的篩選和鑒定時具有更大的適應性，并賦予其一定的操作靈活性，具有廣泛的應用前景。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下：本發明提供了一種基于lacZ基因和pUC復制子的原核啟動子報告系統，所述報告系統包括源自于pFLX107的pUC復制子，氯霉素乙酰轉移酶基因，核糖體RNA操縱子T1T2終止子，lambda t0轉錄終止子，以及源自于質粒pRCL且內部ClaI、SacI和NdeI位點被沉默突變的lacZ基因。

其中，所述緊鄰lacZ基因上游的啟動子探測區域含有SphI，PstI，EcoRI，XhoI，KpnI，SacI，SpeI和BglII多克隆位點，所述lambda t0轉錄終止子位于多克隆位點前。

本發明內容還包括所述的原核啟動子報告系統的構建方法，包括以下步驟：

1)通過定點突變將lacZ基因中的ClaI、SacI和NdeI位點消除，并克隆至質粒pFLX107中啟動子pR后的BglII和Xba I酶切位點之間，構建成含報告基因lacZ的重組質粒pFLX107-lacZ；