[發明專利]一種呼吸道傳染病毒核酸快速富集擴增方法

在審

• 申請號: 202010111805.9
• 申請日: 2020-02-24
• 公開（公告）號: CN111394425A
• 公開（公告）日: 2020-07-10
• 發明（設計）人: 周建華;劉廙人
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 陳衛;禹小明

本發明公開了一種呼吸道傳染病毒核酸快速富集擴增方法，包括以下步驟：S1、受試者將呼吸氣體通過呼氣管呼入裝有消化裂解液的核酸提取管內，其中，所述呼氣管內壁設有核酸富集載體，呼氣管的末端位置位于核酸提取管液面下；S2、將呼氣管轉移固定至裝有核酸洗脫液和核酸擴增液的核酸擴增管內，充分混勻，其中，呼氣管的末端位置位于核酸擴增管液面下；S3、去除恒溫加熱套的封套，將核酸擴增管放置于恒溫加熱套內，進行擴增反應；通過直接采集受試者氣溶膠，即可快速完成氣溶膠樣品中核酸提取富集、洗脫、擴增，擴增產物的沉淀可提供可視化定性依據，加入熒光探針后，還可進一步進行精準定量的分子診斷工作。

技術領域

本發明涉及病毒核酸提純富集放大技術領域，更具體地，涉及一種呼吸道傳染病毒核酸快速富集擴增方法。

背景技術

對于呼吸道傳染病毒，拭子采樣法是目前常用的病毒采集策略，如咽拭子和鼻咽拭子采樣法，以口腔唾液、咽部痰液或鼻咽部粘液為采樣對象，這類策略雖然采樣方法簡單，但在實際應用上有較為明顯的缺陷：

（1）樣本有效性較差。對于潛伏期較長但發病迅猛的呼吸道傳染病，如2019新型冠狀病毒（Novel coronavirus pneumonia，NCP, 2019-nCoV），在口腔唾液中能夠發現病毒的時間并不是最早的預防期，不能最快地在患者潛伏期中明確疾病的定性結果，而可以產生咽部痰液的時間則已處于發病期，更不利于疾病的早期快速診斷。

（2）處理流程較長。拭子采樣法在拭子上收集的樣品需要經過解離、洗脫的處理才能進行樣品中細胞裂解、蛋白脂質消化等過程，僅這一過程一般需要花去60 min左右的時間，此后才能進行核酸提取純化等操作。此外，處理過程中，拭子對處理溶液的吸收能力較強，從而降低了核酸的提取效率。

（3）核酸保存能力差。拭子本身不具有保持核酸分子，特別是RNA分子活性的能力，采樣完成后如果沒有及時進行下一步處理，可能會由于樣品中的RNA酶等因素導致靶標RNA的失活降解，影響檢測結果的保真度。

此外，拭子采樣提取核酸分子后，臨床上核酸的分子診斷主要采用聚合酶鏈式反應（PCR）進行放大擴增，然后通過熒光或化學發光的手段進行定性或定量分析，這一過程最顯著的缺陷之一是PCR控溫過程帶來較長的擴增時間。PCR技術通過控溫程序，在至少三個溫度段中分別完成核酸解鏈、互補鏈延伸、核酸擴增的工序。對于RNA病毒，第一輪RT-PCR所需時間將近60 min，若進行多重巢式RT-PCR擴增，則需要耗費的時間尺度更大。

在上述因素的共同作用下，以上述技術為基礎的核酸檢測條件不能滿足呼吸道疾病快速現場診斷的要求，在醫院或診所中，通常需要確診患者等待數小時或隔天領取檢驗報告才能告知結果。對于傳播性較強的呼吸道傳染病，如2019新型冠狀病毒，期間的人員流動將大幅增加傳染病的傳播范圍，不利于防疫工作的有效開展。

與之相比，呼吸道氣溶膠作為核酸提取對象的策略，能夠更直接地與患者，特別是肺炎患者的整體病毒狀態建立聯系，這種策略具有流程簡便、提取效率高的特點。但是，呼吸道氣溶膠較難儲存，RNA片段在氣溶膠中的壽命較短、活性較差，采集后需要馬上進行處理或保存。此外，呼吸道氣溶膠中雖然能反映患者呼吸道整體的病毒狀態，但其中極低的病毒含量導致可提取核酸片段濃度較低，需要銜接核酸分子擴增手段，而傳統的PCR方法擴增由于設備和控溫程序的要求，難以實現便捷快速的擴增過程。

發明內容

本發明的主要目的在于克服上述不足之處，提供一種呼吸道傳染病毒核酸快速富集擴增方法，通過直接采集受試者氣溶膠，即可快速完成氣溶膠樣品中核酸提取富集、洗脫、擴增，擴增產物的沉淀可提供可視化定性依據，加入熒光探針后，還可進一步進行精準定量的分子診斷工作。

本發明是通過以下技術方案進行實現的：

一種呼吸道傳染病毒核酸快速富集擴增方法，包括以下步驟：