[發(fā)明專利]MT2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化用檢測(cè)引物與檢測(cè)方法以及應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010110282.6
• 申請(qǐng)日: 2020-02-24
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111088350A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-05-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王帆;康毅敏;李慧;劉彥隆;王鵬翔;李存保
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6883
• 分類號(hào): C12Q1/6883;C12N15/11
• 代理公司: 北京華仁聯(lián)合知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11588
• 代理人: 尹春雷

本發(fā)明提出了一種MT2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化用檢測(cè)引物與檢測(cè)方法以及應(yīng)用，本發(fā)明的MT2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化用檢測(cè)方法可以方便快捷地在分子水平上實(shí)現(xiàn)對(duì)抑郁癥患者睡眠障礙的預(yù)測(cè)。本發(fā)明把用于檢測(cè)MT2基因啟動(dòng)子甲基化程度與使用多導(dǎo)睡眠監(jiān)測(cè)儀相結(jié)合，應(yīng)用配對(duì)樣本T檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)分析，預(yù)測(cè)抑郁癥患者的睡眠障礙。通過(guò)新穎的甲基化檢測(cè)方法，使MT2基因與多導(dǎo)睡眠監(jiān)測(cè)儀相結(jié)合實(shí)現(xiàn)對(duì)抑郁癥患者睡眠障礙預(yù)測(cè)，從而在全面、綜合地考察抑郁癥的睡眠障礙相關(guān)標(biāo)記物的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)標(biāo)記物的合理篩選。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別是指一種MT2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化用檢測(cè)引物與檢測(cè)方法以及應(yīng)用。

背景技術(shù)

抑郁癥是最常見(jiàn)的精神障礙，已位居中國(guó)疾病負(fù)擔(dān)的第二位。睡眠障礙是抑郁癥最常見(jiàn)的癥狀之一。90％以上的抑郁癥患者存在不同程度的睡眠障礙。睡眠障礙與患者的低生命質(zhì)量、社會(huì)功能缺陷、心血管疾病和高自殺率相關(guān)。多導(dǎo)睡眠圖是目前臨床上檢測(cè)睡眠障礙的標(biāo)準(zhǔn)方法。然而，臨床上尚缺乏預(yù)測(cè)抑郁癥患者出現(xiàn)睡眠障礙的方法。因此，建立預(yù)測(cè)抑郁癥患者睡眠障礙的技術(shù)方法，對(duì)抑郁癥的診療有重大意義。

抑郁癥是最常見(jiàn)的精神障礙，已位居中國(guó)疾病負(fù)擔(dān)的第二位。睡眠障礙是抑郁癥最常見(jiàn)的癥狀之一。90％以上的抑郁癥患者存在不同程度的睡眠障礙。睡眠障礙與患者的低生命質(zhì)量、社會(huì)功能缺陷、心血管疾病和高自殺率相關(guān)。其中早醒是抑郁癥最具特異性的睡眠障礙。多導(dǎo)睡眠圖顯示為睡眠各期時(shí)相轉(zhuǎn)換增多，I期睡眠增多，睡眠效率及睡眠維持率降低；慢波睡眠減少，快速動(dòng)眼潛伏期縮短，快速動(dòng)眼睡眠時(shí)程延長(zhǎng)及快速動(dòng)眼密度增加等快速動(dòng)眼活力增強(qiáng)的表現(xiàn)。快速動(dòng)眼潛伏期縮短被認(rèn)為是重癥抑郁的精神生物學(xué)指標(biāo)。睡眠障礙的發(fā)生率和嚴(yán)重程度部分取決于抑郁癥的嚴(yán)重程度。

抑郁癥可導(dǎo)致褪黑素的合成減少。褪黑素作為一種節(jié)律信號(hào)，可以矯正人體生物鐘，改善抑郁癥患者睡眠和調(diào)整晝夜節(jié)律。通過(guò)與褪黑素受體2(MT2)結(jié)合，增加下丘腦GABA的含量，促進(jìn)下丘腦GABA的釋放，通過(guò)GABA受體起到縮短睡眠潛伏期和延長(zhǎng)睡眠時(shí)間的作用。還可減少促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素等的分泌，負(fù)調(diào)節(jié)HPA軸，降低應(yīng)激時(shí)血皮質(zhì)醇濃度，從而調(diào)節(jié)生物鐘發(fā)揮調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律睡眠覺(jué)醒周期的獨(dú)特作用，治療睡眠節(jié)律障礙，改善睡眠，血漿褪黑素水平的高低具有作為抑郁癥診斷標(biāo)準(zhǔn)的價(jià)值。

抑郁癥出現(xiàn)睡眠障礙是一種由遺傳因素和環(huán)境因素共同作用而引起的復(fù)雜性疾病，表觀遺傳修飾可以為環(huán)境因素與基因組的相互作用機(jī)理提供直接的解釋。DNA甲基化是最常見(jiàn)的表觀遺傳學(xué)修飾，啟動(dòng)子區(qū)域甲基化抑制基因轉(zhuǎn)錄，表現(xiàn)為外周蛋白質(zhì)水平降低。DNA甲基化調(diào)節(jié)基因表達(dá)，引起抑郁癥的發(fā)生。生物晝夜節(jié)律與睡眠障礙相關(guān)基因同樣存在DNA甲基化差異。與對(duì)照組相比，抑郁癥患者大部分腦區(qū)基因表達(dá)下調(diào)，基因啟動(dòng)子區(qū)存在高度DNA甲基化。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提出一種MT2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化用檢測(cè)引物與檢測(cè)方法以及應(yīng)用，對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中抑郁癥出現(xiàn)的睡眠障礙的預(yù)測(cè)具有重要作用。

本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：一種MT2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化用檢測(cè)引物，包括用于MT2基因啟動(dòng)子PCR擴(kuò)增的上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列為：SEQID NO.1，所述下游引物的核苷酸序列為：SEQ ID N0.2。

一種MT2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化用檢測(cè)方法，包括以下步驟：步驟1，采集抑郁癥患者靜脈血，提取基因組DNA；步驟2，重亞硫酸鹽處理DNA樣品，低速短暫離心備用；步驟3，以步驟2中的DNA為模板，使用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2為引物擴(kuò)增MT2基因啟動(dòng)子，獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；步驟4，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增成功的樣品；步驟5，將擴(kuò)增成功的樣品進(jìn)行SAP反應(yīng)；步驟6，T切/RNase A消化反應(yīng)；步驟7，樹(shù)脂純化；步驟8，芯片點(diǎn)樣；步驟9，將點(diǎn)樣后的芯片使用MALDI-TOF分析，計(jì)算出DNA樣品的甲基化程度。

進(jìn)一步，步驟1中采集抑郁癥患者的靜脈血和藥物治療后的靜脈血，分別提取基因組DNA，每種靜脈血至少提取兩個(gè)樣本。