[發明專利]基于雙鏈DNA肽連接酶的JAK1基因特定突變檢測試劑盒及方法

有效

• 申請號: 202010109655.8
• 申請日: 2020-02-22
• 公開（公告）號: CN111088363B
• 公開（公告）日: 2022-08-16
• 發明（設計）人: 黃志玲;黃種山;其他發明人請求不公開姓名
• 申請（專利權）人: 黃志清
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6869;C12Q1/6806
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明提供了一種基于雙鏈DNA肽連接酶的JAK1基因g.[227149insA]突變檢測試劑盒及方法，是在指數擴增前就直接先對目標基因突變片段進行捕獲富集，然后再對目標基因突變片段進行特異性擴增和檢測的。JAK1基因g.[227149insA]檢測試劑盒主要包括：dDPlaseII連接酶，dDPlaseII連接酶緩沖液，RNase H酶，磁載多肽Ps，RNA引物Pr，DNA引物Pn，DNA片段Pd和DNA引物Pm，其中dDPlaseII連接酶其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；檢測方法主要包括前擴增、RNase H酶消化、dDPlaseII酶連接和磁珠分離、特異性擴增這4部分。本發明提供的檢測試劑盒和檢測方法，具有特異性強和準確高效、簡便經濟的特點，可以有效檢測出樣本中含量低至1%的JAK1基因g.[227149insA]突變，可以應用于中年女性結直腸癌患者肝轉移的預測和診治中。

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，具體涉及一種基于雙鏈DNA肽連接酶的JAK1基因g.[227149insA]突變檢測試劑盒及其檢測方法。

背景技術

基因是生物體的遺傳物質，由其表達的蛋白質承擔著生物體內的各項生命機能。基因發生變異或突變將導致生物體出現不同的生物特性或疾病狀態。基因突變是基因在其分子結構上發生的核苷酸組成或排列順序的改變，主要包括點突變、移碼突變、缺失突變和插入突變這四種。基因突變和腫瘤的發生發展密切相關。目前，腫瘤已成為全世界范圍內發病率和致死率最高的疾病。根據國家癌癥中心2019年發布的數據顯示，我國2015年新發癌癥病例約392.9萬例（平均每天超過1萬人被確診為癌癥），死亡人數約233.8萬例；近10多年來，我國癌癥發病率每年保持約3.9％的增幅，死亡率每年保持約2.5％的增幅，給國人的生命健康造成了重大的威脅和沉重的負擔。

在癌癥診治過程中常采用的血清腫瘤標志物和CT等檢測手段具有局限性，首先其敏感性和特異性均不高，其次發現有異常時往往已是中晚期，最關鍵的是無法準確反映出癌灶的分子特征。癌癥是一種基因疾病，其發生發展過程中涉及了各種基因突變，它是一個多基因突變累積的過程。因此解析癌癥樣本中存在的基因突變尤其是驅動基因等關鍵基因的特定突變，才能從分子本質上體現癌癥的真實狀況，這對于探究癌癥的發生發展機制和預測癌癥的發展變化，對于癌癥的篩查和診斷，對于癌癥的用藥和治療等方面都具有重要的意義。然而在癌癥樣本中，癌灶部分往往只占檢材中的一部分，并且發生特定基因突變的癌細胞也只是癌灶中的一部分（癌灶的異質性），即癌癥檢測樣本中常常存在著大量的野生型基因，尤其是在早癌樣本中突變基因只占微小的比例，因此要從中準確有效地檢測出特定的基因突變將具有很大的挑戰性。

目前有多種分子技術可用于癌癥基因突變的檢測，如PCR-Sanger測序法、實時熒光定量PCR、擴增阻滯突變系統PCR（ARMS-PCR）、數字PCR、變性高效液相色譜法（D-HPLC）以及二代測序（NGS）等方法。其中多數是基于PCR的方法，然而常規PCR擴增時無法區分野生型基因和突變基因，必需進行特定的設計或解析。如常規應用的PCR-Sanger測序法，就是擴增出特定基因片段，然后進行Sanger測序，利用測序峰圖來分析特定基因位點的突變情況；再如商品化的ARMS技術，就是設計針對特定基因突變的擴增引物和檢測探針，來實現特定基因突變的特異擴增和檢測的；再如非常熱門的二代測序技術，就是首先無區分地擴增特定基因片段，再利用二代測序超高通量的并行測序能力測出所有擴增基因片段，最后解析其中的突變。

本發明借助于申請人前期研究獲取的雙鏈DNA肽連接酶dDPlaseII（詳見申請人之前提交的發明專利申請：一種雙鏈DNA肽連接酶dDPlaseII及使用方法，申請號：2020100773289），提出了一種特定基因突變的檢測新方法，與現有方法不同的是本發明方法是在指數擴增前，先利用dDPlaseII酶連接和磁珠吸附直接對目標基因突變片段進行捕獲富集，然后再對目標基因突變片段進行特異性擴增和檢測的。這是一種全新的特定基因突變檢測方法，具有特異性強和準確高效、簡便經濟的特點。基于此，本發明將其應用于JAK1基因g.[227149insA]突變的檢測，提供了具體的檢測試劑盒及其檢測方法。

發明內容