[發(fā)明專利]一種滋養(yǎng)細(xì)胞、其制備方法及其在高效擴增NK細(xì)胞中的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010108822.7
• 申請日: 2020-02-21
• 公開（公告）號: CN111304255B
• 公開（公告）日: 2023-06-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張云龍
• 申請（專利權(quán)）人: 中邦干細(xì)胞科技有限公司
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N5/10;C12N5/0783
• 代理公司: 石家莊君聯(lián)專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 13125
• 代理人: 張柳云

本發(fā)明涉及一種滋養(yǎng)細(xì)胞、其制備方法及其在高效擴增NK細(xì)胞中的應(yīng)用，該制備方法包括S1，pLenti?mbIL21?4.1BBL?CD16A?OX40L質(zhì)粒載體的構(gòu)建；S2，重組慢病毒的包裝；S3，K562?mbIL21?4.1BBL?CD16A?OX40L滋養(yǎng)細(xì)胞的制備；S4，臍血或外周血白膜層細(xì)胞的制備；S5，NK細(xì)胞的體外擴增；本發(fā)明通過滋養(yǎng)細(xì)胞為NK細(xì)胞提供IL21、4.1BBL、CD16A、OX40L等多個刺激分子來激活NK細(xì)胞，從而促使其體外大量增殖；NK細(xì)胞經(jīng)過一個14天的增殖周期，能擴增10000倍以上，制得的NK細(xì)胞純度能達到90％以上，相較于傳統(tǒng)的表達IL21和4.1BBL滋養(yǎng)細(xì)胞刺激NK培養(yǎng)方法，本發(fā)明方法得到的NK細(xì)胞純度，質(zhì)量以及數(shù)量都有明顯提高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程和細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及到一種能激活多個信號通路的滋養(yǎng)細(xì)胞、其制備方法及其在高效擴增NK細(xì)胞中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

NK細(xì)胞是一種先天性免疫細(xì)胞，它是病毒感染細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的天然殺手。與T細(xì)胞不同的是，NK細(xì)胞能通過其上的抑制受體KIR和NKG2A以及激活受體NKG2D、CD16以及NKp30來識別反常細(xì)胞，當(dāng)靶細(xì)胞低水平表達抑制配體并且高水平表達激活配體時，就能導(dǎo)致NK細(xì)胞激活，釋放穿孔素和顆粒酶來殺死靶細(xì)胞。

除了直接的抗腫瘤作用，NK細(xì)胞還能參與后天性的抗腫瘤反應(yīng)，能起到免疫調(diào)解功能。

NK細(xì)胞主要在外周血中分布，一般成人的NK細(xì)胞占外周血單個核細(xì)胞的5％到10％，淋巴結(jié)和骨髓也有少量的NK細(xì)胞，而且大多數(shù)是處于靜息狀態(tài)。在NK細(xì)胞腫瘤免疫治療中，往往需要很大數(shù)量的NK細(xì)胞才有比較好的治療效果，因而，如何在體外高效擴增NK細(xì)胞是治療癌癥的關(guān)鍵所在。

目前，NK細(xì)胞的擴增方式主要有兩種，一種是通過IL2、IL12、IL15、IL18、IL21等細(xì)胞因子來對NK細(xì)胞刺激擴增，這種方法的缺陷是成本較高，而且NK細(xì)胞增殖的倍數(shù)較少。另一種是通過滋養(yǎng)細(xì)胞刺激NK細(xì)胞增殖。目前最常用的滋養(yǎng)細(xì)胞是經(jīng)過輻射的表達IL21和4.1BBL的K562細(xì)胞。對于NK細(xì)胞來說，IL21刺激能增強IFN-γ分泌、上調(diào)NK細(xì)胞穿孔素的分泌和表達、增強NK細(xì)胞毒功能，同時加速NK細(xì)胞的成熟和提高NK細(xì)胞激活受體的表達。4.1BBL也能調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的激活信號傳導(dǎo)。但這種方法也有擴增倍數(shù)不夠理想，擴增的NK細(xì)胞CD56⁺CD16⁺雙陽性比例低等缺陷。因而臨床細(xì)胞免疫治療急需一種更高效高質(zhì)的NK細(xì)胞體外擴增方法。

人們現(xiàn)在知道治療性抗體能明顯提高NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的毒性，這種抗體依賴的細(xì)胞毒作用(ADCC)是通過結(jié)合治療性抗體的Fc部分到NK細(xì)胞的激活受體CD16，從而促使NK細(xì)胞激活。最近有人報道，通過OX40受體來激活NK細(xì)胞能增加NK細(xì)胞的IFN-γ分泌、細(xì)胞毒性以及增殖，OX40L是一個很好的提高NK細(xì)胞增殖的分子靶標(biāo)。能否在K562穩(wěn)定表達IL21和4.1BBL的基礎(chǔ)上，同時表達NK細(xì)胞激活受體CD16的單鏈抗體CD16A和OX40的配體OX40L，利用這4種分子同時表達在K562細(xì)胞上，然后再作為滋養(yǎng)細(xì)胞來培養(yǎng)NK細(xì)胞，從而提高擴增的NK細(xì)胞的質(zhì)量和數(shù)量是目前本領(lǐng)域亟待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)的培養(yǎng)方法中NK細(xì)胞CD56⁺CD16⁺雙陽性比例低、擴增倍數(shù)低等問題，本發(fā)明的目的在于提供一種能激活多個信號通路的滋養(yǎng)細(xì)胞、其制備方法及其在高效擴增NK細(xì)胞中的應(yīng)用，利用IL21、4.1BBL、CD16A、OX40L同時表達在K562細(xì)胞，并通過puromycin進行篩選，獲得這4種分子同時高表達在細(xì)胞膜上的滋養(yǎng)細(xì)胞來培養(yǎng)NK細(xì)胞，最終獲得高質(zhì)量和高數(shù)量的體外擴增NK細(xì)胞。

本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問題是采用以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的。