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[發明專利]一種滋養細胞、其制備方法及其在高效擴增NK細胞中的應用有效

專利信息
申請號: 202010108822.7 申請日: 2020-02-21
公開(公告)號: CN111304255B 公開(公告)日: 2023-06-09
發明(設計)人: 張云龍 申請(專利權)人: 中邦干細胞科技有限公司
主分類號: C12N15/867 分類號: C12N15/867;C12N5/10;C12N5/0783
代理公司: 石家莊君聯專利代理事務所(特殊普通合伙) 13125 代理人: 張柳云
地址: 066000 河北省秦皇*** 國省代碼: 河北;13
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摘要:
搜索關鍵詞: 一種 滋養 細胞 制備 方法 及其 高效 擴增 nk 中的 應用
【權利要求書】:

1.一種pLenti-mbIL21-4?.1BBL-CD16A-OX40L質粒載體,其特征在于,包括如SEQIDNO:5所示的整個載體連續編碼區序列IL21-F2A-4?.1BBL-E2A-CD16A-P2A-OX40L-T2A。

2.一種權利要求1所述的pLenti-mbIL21-4?.1BBL-CD16A-OX40L質粒載體的制備方法,其特征在于,包括以下步驟:

?S11,利用基因合成的方法合成E2A-CD16A-P2A-OX40L-T2A-puro基因的全長編碼區序列;

S12,將CD16A-P2A-OX40L基因構建到慢病毒質粒載體pLenti-mbIL21-4.1BBL載體上,形成pLenti-mbIL21-4.1BBL-CD16A-OX40L質粒載體。

3.一種K562-mbIL21-4.1BBL-CD16A-OX40L滋養細胞的制備方法,其特征在于,包括以下步驟:

S31,將1-2million的旺盛生長的K562細胞放入24孔板中的一個孔進行培養,培養基為1-2毫升含有10%wtFBS的1640培養基;

S32,再將30-35毫升病毒上清液超速離心濃縮的300μL慢病毒顆粒加入孔中,培養5-6天后,再用1-4μg/ml的Puromycin進行選擇性培養,所述慢病毒顆粒包含權利要求1所述的pLenti-mbIL21-4?.1BBL-CD16A-OX40L質粒載體;

S33,用流式檢測K562-mbIL21-4?.1BBL-CD16A-OX40L的4個基因在K562細胞的表達,使各個基因的表達在80%以上;

S34,再用100Gy的γ射線照射10分鐘,-80℃冰箱進行凍存。

4.一種K562-mbIL21-4?.1BBL-CD16A-OX40L滋養細胞,其特征在于,所述滋養細胞是通過權利要求3所述的方法制備得到的。

5.一種NK細胞的制備方法,其特征在于,包括以下步驟:將權利要求1所述的質粒載體包裝慢病毒顆粒后,再將所述慢病毒顆粒侵染滋養細胞系,獲得能夠表達目的基因的滋養細胞,再利用滋養細胞在體外大量擴增NK細胞,得到高質量的NK細胞。

6.如權利要求5所述的制備方法,其特征在于,所述目的基因包括IL21、4?.1BBL、CD16A和OX40L中的至少一種;所述滋養細胞系包括腫瘤細胞。

7.如權利要求5或6所述的制備方法,其特征在于,包括以下步驟:

S1,pLenti-mbIL21-4?.1BBL-CD16A-OX40L質粒載體的構建;

S2,用pLenti-mbIL21-4?.1BBL-CD16A-OX40L質粒載體包裝慢病毒顆粒;

S3,K562-mbIL21-4?.1BBL-CD16A-OX40L滋養細胞的制備;

S4,臍血或外周血白膜層細胞的制備;

S5,NK細胞的體外擴增。

8.如權利要求7所述的制備方法,其特征在于,步驟S2具體包括:

S21,重組慢病毒的包裝制備;

S22,重組慢病毒的超速離心濃縮。

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