[發明專利]一種滋養細胞、其制備方法及其在高效擴增NK細胞中的應用有效
| 申請號： | 202010108822.7 | 申請日： | 2020-02-21 |
| 公開（公告）號： | CN111304255B | 公開（公告）日： | 2023-06-09 |
| 發明（設計）人： | 張云龍 | 申請（專利權）人： | 中邦干細胞科技有限公司 |
| 主分類號： | C12N15/867 | 分類號： | C12N15/867;C12N5/10;C12N5/0783 |
| 代理公司： | 石家莊君聯專利代理事務所(特殊普通合伙) 13125 | 代理人： | 張柳云 |
| 地址： | 066000 河北省秦皇*** | 國省代碼： | 河北;13 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 滋養 細胞 制備 方法 及其 高效 擴增 nk 中的 應用 | ||
1.一種pLenti-mbIL21-4?.1BBL-CD16A-OX40L質粒載體，其特征在于，包括如SEQIDNO:5所示的整個載體連續編碼區序列IL21-F2A-4?.1BBL-E2A-CD16A-P2A-OX40L-T2A。
2.一種權利要求1所述的pLenti-mbIL21-4?.1BBL-CD16A-OX40L質粒載體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
?S11，利用基因合成的方法合成E2A-CD16A-P2A-OX40L-T2A-puro基因的全長編碼區序列；
S12，將CD16A-P2A-OX40L基因構建到慢病毒質粒載體pLenti-mbIL21-4.1BBL載體上，形成pLenti-mbIL21-4.1BBL-CD16A-OX40L質粒載體。
3.一種K562-mbIL21-4.1BBL-CD16A-OX40L滋養細胞的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
S31，將1-2million的旺盛生長的K562細胞放入24孔板中的一個孔進行培養，培養基為1-2毫升含有10％wtFBS的1640培養基；
S32，再將30-35毫升病毒上清液超速離心濃縮的300μL慢病毒顆粒加入孔中，培養5-6天后，再用1-4μg/ml的Puromycin進行選擇性培養，所述慢病毒顆粒包含權利要求1所述的pLenti-mbIL21-4?.1BBL-CD16A-OX40L質粒載體；
S33，用流式檢測K562-mbIL21-4?.1BBL-CD16A-OX40L的4個基因在K562細胞的表達，使各個基因的表達在80％以上；
S34，再用100Gy的γ射線照射10分鐘，-80℃冰箱進行凍存。
4.一種K562-mbIL21-4?.1BBL-CD16A-OX40L滋養細胞，其特征在于，所述滋養細胞是通過權利要求3所述的方法制備得到的。
5.一種NK細胞的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：將權利要求1所述的質粒載體包裝慢病毒顆粒后，再將所述慢病毒顆粒侵染滋養細胞系，獲得能夠表達目的基因的滋養細胞，再利用滋養細胞在體外大量擴增NK細胞，得到高質量的NK細胞。
6.如權利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述目的基因包括IL21、4?.1BBL、CD16A和OX40L中的至少一種；所述滋養細胞系包括腫瘤細胞。
7.如權利要求5或6所述的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
S1，pLenti-mbIL21-4?.1BBL-CD16A-OX40L質粒載體的構建；
S2，用pLenti-mbIL21-4?.1BBL-CD16A-OX40L質粒載體包裝慢病毒顆粒；
S3，K562-mbIL21-4?.1BBL-CD16A-OX40L滋養細胞的制備；
S4，臍血或外周血白膜層細胞的制備；
S5，NK細胞的體外擴增。
8.如權利要求7所述的制備方法，其特征在于，步驟S2具體包括：
S21，重組慢病毒的包裝制備；
S22，重組慢病毒的超速離心濃縮。
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