[發(fā)明專(zhuān)利]一種肝纖維化抗體蛋白芯片的制備以及在診斷纖維化分期中的應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010108061.5
• 申請(qǐng)日: 2020-02-21
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111337684A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-06-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周洋;王凱;張書(shū)源;張子謙
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): G01N33/68
• 分類(lèi)號(hào): G01N33/68;G01N33/577;G01N33/552
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11617
• 代理人: 栗華楠

1.一種肝纖維化抗體蛋白芯片的制備以及在診斷肝纖維化分期中的應(yīng)用，其特征在于所述的具體制備及診斷方法如下：

(1)建立不同病因肝纖維化患者血清生物標(biāo)志物的樣本庫(kù)

在全國(guó)各省市有代表性的多家醫(yī)院，患者知情同意，醫(yī)院倫理審查通過(guò)的前提下，收集三年內(nèi)肝臟穿刺活檢并確診為肝纖維化患者以及100例健康志愿者(肝功正常、肝炎病毒陰性、肝臟影像學(xué)無(wú)異常)的血液樣本，建立樣本庫(kù)。根據(jù)臨床資料和診療經(jīng)過(guò)盡可能將患者分為慢性乙型肝炎(CHB)、慢性丙型肝炎(CHC)、酒精性肝病(ALD)、非酒精性脂肪肝(NAFLD)、肝硬化(LC)。同時(shí)將入組患者和健康志愿者的全部醫(yī)療信息進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)登記，統(tǒng)一管理。

(2)篩選敏感度特異度較高的生物標(biāo)志物

利用RT-PCR和Western-blot分別檢測(cè)19種已知的有潛能的肝纖維化相關(guān)血清生物標(biāo)志物：前膠原ⅢN-末端肽(PⅢNP)、Ⅰ型前膠原羧基端肽(PICP)、IV型膠原(CⅣ)、層黏連接蛋白(LN)、透明質(zhì)酸(HA)、糖蛋白YKL-40、MMP-2(白明膠酶A)、MMP-3(基質(zhì)分解素)、MMP-9(白明膠酶B)、TIMP1(金屬蛋白酶組織抑制因子1)、TIMP2(金屬蛋白酶組織抑制因子2)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)、木糖酰轉(zhuǎn)移酶(XT)、對(duì)氧磷酶1(PON-1)、集落刺激因子(CSF)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-1)在肝纖維化病人及健康志愿者中的基因和蛋白質(zhì)表達(dá)水平，并結(jié)合影像學(xué)檢查結(jié)果篩選出敏感度和特異度較高的候選者。應(yīng)用ELISA技術(shù)對(duì)所篩選出的的特異標(biāo)志物進(jìn)行含量測(cè)定。

(3)制備對(duì)應(yīng)肝組織活檢分期的抗體蛋白芯片

A：芯片的選擇：選用載玻片作為片基，將載玻片硅烷化。

B：抗體芯片的制備：將上述生物標(biāo)志物的單克隆抗體通過(guò)點(diǎn)陣法在載玻片上進(jìn)行點(diǎn)樣，制備好的芯片放入濕盒中，4℃過(guò)夜。

C：血清樣本的標(biāo)記：將血清樣本進(jìn)行生物素標(biāo)記，備用。

D：抗體芯片檢測(cè)血清樣本：將制備好的抗體芯片于室溫下封閉1小時(shí)，洗滌后將血清樣本加樣于芯片上，加熒光染料孵育后洗滌，用熒光芯片掃描儀進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)。所得檢測(cè)數(shù)據(jù)與ELISA測(cè)定的數(shù)值相匹配，確定對(duì)應(yīng)的0-4期的熒光信號(hào)強(qiáng)度。

(4)建立肝纖維化標(biāo)志物蛋白抗體芯片檢測(cè)系統(tǒng)

對(duì)于進(jìn)行肝組織活檢的肝纖維化患者，根據(jù)其Scheuer評(píng)分系統(tǒng)的結(jié)果0-4期，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法找到篩選出來(lái)的血清生物學(xué)標(biāo)志物在各個(gè)期的差異，從而確定能代表每個(gè)期別的最佳血清生物學(xué)標(biāo)志物，并通過(guò)大規(guī)模的樣本庫(kù)確定合理的數(shù)值變異范圍。

例如：應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件和Med-calc軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。繪制受試者工作特征曲線(ROC曲線)來(lái)確定最佳診斷臨界值。根據(jù)繪制出來(lái)的ROC曲線得到篩選出的生物標(biāo)志物用來(lái)區(qū)分不同分期肝纖維化患者的臨界值，抗體芯片信號(hào)值大于該臨界值設(shè)定為陽(yáng)性，并得出生物標(biāo)志物在不同分組間的陽(yáng)性率，計(jì)算不同生物標(biāo)志物陽(yáng)性率的差異，從而確定能代表每個(gè)期別的最優(yōu)血清生物學(xué)標(biāo)志物。