[發明專利]一種弓形蟲雙基因缺失蟲株及其構建方法與應用

在審

• 申請號: 202010106665.6
• 申請日: 2020-02-21
• 公開（公告）號: CN111154654A
• 公開（公告）日: 2020-05-15
• 發明（設計）人: 劉群;張恒;劉晶;烏藝晗
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N1/11
• 分類號: C12N1/11;C12N15/113;C12N15/30;C12N15/65;C12N15/90;A61K39/002;A61P33/02;C12R1/10
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

本發明公開了一種弓形蟲雙基因缺失蟲株的構建方法及其在作為弱毒疫苗中的應用。該弓形蟲雙基因缺失蟲株是在弓形蟲RHΔKu80蟲株的基礎上，利用CRISPR/Cas9基因敲除技術，同時敲除弓形蟲蟲株中的DNA損傷誘導蛋白1基因(ddi1)和紫外剪切修復蛋白23基因(rad23)兩個基因，獲得ΔΔddi1rad23雙基因缺失蟲株。通過實驗證明：ΔΔddi1rad23雙基因缺失蟲株的生長繁殖能力和毒力明顯降低，使用該蟲株免疫小鼠后再次攻擊強毒株能夠對小鼠提供較好的保護，可有效抵抗弓形蟲再次感染。本發明的弓形蟲雙基因缺失蟲株有作為弓形蟲弱毒活疫苗的潛力，為進一步研制弓形蟲弱毒疫苗奠定基礎。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種弓形蟲雙基因缺失蟲株及其構建方法與應用，特別涉及泛素-蛋白酶體系統中的兩個穿梭蛋白基因缺失的弓形蟲蟲株及其構建方法與在作為弓形蟲弱毒疫苗中的應用。

背景技術

龔地弓形蟲(Toxoplasma gondii，簡稱弓形蟲)是一種專性細胞內寄生原蟲，隸屬于頂復亞門，幾乎感染所有的溫血動物和人，是一種危害嚴重的人獸共患病原。弓形蟲感染廣泛，危害宿主的形式多樣，對不同宿主、不同生長或生理階段的危害程度也有很大差異。在宿主免疫力正常的情況下，大多為隱性感染；嬰兒、免疫抑制患者感染弓形蟲可能導致嚴重或致命的疾病，弓形蟲感染還是導致妊娠動物和孕婦發生流產、死胎及其他繁殖生殖障礙的重要原因，在我國常有仔豬急性弓形蟲病的報道。

目前，弓形蟲病的防治手段主要是磺胺類藥物用于急性弓形蟲病的治療，但并不能徹底治愈弓形蟲病。上個世紀九十年代，在歐洲有一種弱毒疫苗應用于預防綿羊弓形蟲病引起的流產，但因為效果及其公共衛生問題，未能夠廣泛應用；迄今未見其它商品化疫苗應用于人和動物的弓形蟲病預防。因此，研發弓形蟲病疫苗具有重要應用價值。

DNA損傷誘導蛋白1(ddi1)和紫外剪切修復蛋白23(rad23)都屬于UBL-UBA穿梭蛋白家族，該家族蛋白是泛素-蛋白系統的重要組成成分，主要功能是識別和轉運泛素化蛋白到蛋白酶體進行降解，這對于維持細胞內蛋白質及氨基酸的穩態具有重要作用，除此之外，還參與DNA損傷修復、細胞周期調控等生命過程，但迄今尚無其在弓形蟲中的研究報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種弓形蟲雙基因缺失蟲株及其構建方法與在作為弓形蟲弱毒疫苗中的應用。

為了實現上述目的，本發明首先提供了一種弓形蟲雙基因缺失蟲株的構建方法。

本發明提供的弓形蟲雙基因缺失蟲株的構建方法包括如下步驟：抑制或沉默弓形蟲蟲株中的DNA損傷誘導蛋白1基因和紫外剪切修復蛋白23基因的表達，得到所述弓形蟲雙基因缺失蟲株；

所述DNA損傷誘導蛋白1基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示；

所述紫外剪切修復蛋白23基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示。

上述方法中，所述抑制或沉默弓形蟲蟲株中的DNA損傷誘導蛋白1基因和紫外剪切修復蛋白23基因的表達為敲除弓形蟲蟲株中的DNA損傷誘導蛋白1基因和紫外剪切修復蛋白23基因。

進一步的，所述敲除弓形蟲蟲株中的DNA損傷誘導蛋白1基因和紫外剪切修復蛋白23基因為將所述弓形蟲蟲株中的DNA損傷誘導蛋白1基因和紫外剪切修復蛋白23基因均替換為抗性基因。

更進一步的，所述將弓形蟲蟲株中的DNA損傷誘導蛋白1基因和紫外剪切修復蛋白23基因均替換為抗性基因的方法為基于CRISPR/Cas9介導的同源重組技術。所述方法包括如下步驟：

1)將含有抗性基因甲的同源重組片段和靶向DNA損傷誘導蛋白1基因的CAS9質粒導入弓形蟲蟲株中，使所述弓形蟲蟲株中的DNA損傷誘導蛋白1基因替換為抗性基因甲，經過篩選和鑒定，得到缺失DNA損傷誘導蛋白1基因的弓形蟲蟲株；