[發(fā)明專利]一種弓形蟲雙基因缺失蟲株及其構(gòu)建方法與應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010106665.6
• 申請(qǐng)日: 2020-02-21
• 公開（公告）號(hào): CN111154654A
• 公開（公告）日: 2020-05-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉群;張恒;劉晶;烏藝晗
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/11
• 分類號(hào): C12N1/11;C12N15/113;C12N15/30;C12N15/65;C12N15/90;A61K39/002;A61P33/02;C12R1/10
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢

1.一種弓形蟲雙基因缺失蟲株的構(gòu)建方法，包括如下步驟：抑制或沉默弓形蟲蟲株中的DNA損傷誘導(dǎo)蛋白1基因和紫外剪切修復(fù)蛋白23基因的表達(dá)，得到所述弓形蟲雙基因缺失蟲株；

所述DNA損傷誘導(dǎo)蛋白1基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示；

所述紫外剪切修復(fù)蛋白23基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述抑制或沉默弓形蟲蟲株中的DNA損傷誘導(dǎo)蛋白1基因和紫外剪切修復(fù)蛋白23基因的表達(dá)為敲除弓形蟲蟲株中的DNA損傷誘導(dǎo)蛋白1基因和紫外剪切修復(fù)蛋白23基因。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述敲除弓形蟲蟲株中的DNA損傷誘導(dǎo)蛋白1基因和紫外剪切修復(fù)蛋白23基因?yàn)閷⒐蜗x蟲株中的DNA損傷誘導(dǎo)蛋白1基因和紫外剪切修復(fù)蛋白23基因均替換為抗性基因。

4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述將弓形蟲蟲株中的DNA損傷誘導(dǎo)蛋白1基因和紫外剪切修復(fù)蛋白23基因均替換為抗性基因的方法為基于CRISPR/Cas9介導(dǎo)的同源重組技術(shù)。

5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步驟：

1)將含有抗性基因甲的同源重組片段和靶向DNA損傷誘導(dǎo)蛋白1基因的CAS9質(zhì)粒導(dǎo)入弓形蟲蟲株中，使所述弓形蟲蟲株中的DNA損傷誘導(dǎo)蛋白1基因替換為抗性基因甲，經(jīng)過篩選和鑒定，得到缺失DNA損傷誘導(dǎo)蛋白1基因的弓形蟲蟲株；

所述含有抗性基因甲的同源重組片段依次包括DNA損傷誘導(dǎo)蛋白1基因上游同源臂、抗性基因甲和DNA損傷誘導(dǎo)蛋白1基因下游同源臂；

2)將含有抗性基因乙的同源重組片段和靶向紫外剪切修復(fù)蛋白23基因的CAS9質(zhì)粒導(dǎo)入所述缺失DNA損傷誘導(dǎo)蛋白1基因的弓形蟲蟲株中，使所述缺失DNA損傷誘導(dǎo)蛋白1基因的弓形蟲蟲株中的紫外剪切修復(fù)蛋白23基因替換為抗性基因乙，經(jīng)過篩選和鑒定，得到缺失DNA損傷誘導(dǎo)蛋白1基因和紫外剪切修復(fù)蛋白23基因的弓形蟲蟲株；

所述含有抗性基因乙的同源重組片段依次包括紫外剪切修復(fù)蛋白23基因上游同源臂、抗性基因乙和紫外剪切修復(fù)蛋白23基因下游同源臂。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于：所述1)中，所述抗性基因甲為氯霉素抗性基因；

所述含有抗性基因甲的同源重組片段的核苷酸序列如序列表中序列3所示；

所述靶向DNA損傷誘導(dǎo)蛋白1基因的CAS9質(zhì)粒為pSAG1-CAS9-U6gRNA(ddi1)；

所述2)中，所述抗性基因乙為乙胺嘧啶抗性基因；

所述含有抗性基因乙的同源重組片段的核苷酸序列如序列表中序列4所示；

所述靶向紫外剪切修復(fù)蛋白23基因的CAS9質(zhì)粒為pSAG1-CAS9-U6gRNA(rad23)。

7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一所述的方法，其特征在于：所述弓形蟲蟲株為具有DNA損傷誘導(dǎo)蛋白1基因和紫外剪切修復(fù)蛋白23基因的弓形蟲蟲株；

或，所述弓形蟲蟲株具體為弓形蟲RH蟲株或弓形蟲RHΔKu80蟲株。

8.按照權(quán)利要求1-7任一所述方法構(gòu)建得到的弓形蟲雙基因缺失蟲株。

9.如下a1)-a4)中任一所述的應(yīng)用：

a1)按照權(quán)利要求1-7任一所述方法構(gòu)建得到的弓形蟲雙基因缺失蟲株在作為弓形蟲疫苗或弓形蟲弱毒疫苗或弓形蟲弱毒活疫苗中的應(yīng)用；

a2)按照權(quán)利要求1-7任一所述方法構(gòu)建得到的弓形蟲雙基因缺失蟲株在制備弓形蟲疫苗或弓形蟲弱毒疫苗或弓形蟲弱毒活疫苗中的應(yīng)用；

a3)按照權(quán)利要求1-7任一所述方法構(gòu)建得到的弓形蟲雙基因缺失蟲株在制備預(yù)防和/或抵抗弓形蟲感染的產(chǎn)品中的應(yīng)用；

a4)按照權(quán)利要求1-7任一所述方法構(gòu)建得到的弓形蟲雙基因缺失蟲株在制備預(yù)防和/或治療弓形蟲病的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

10.如下b1)-b5)中任一種產(chǎn)品，其活性成分為按照權(quán)利要求1-7任一所述方法構(gòu)建得到的弓形蟲雙基因缺失蟲株；

b1)弓形蟲疫苗；

b2)弓形蟲弱毒疫苗；

b3)弓形蟲弱毒活疫苗；

b4)預(yù)防和/或抵抗弓形蟲感染的產(chǎn)品；

b5)預(yù)防和/或治療弓形蟲病的產(chǎn)品。