[發明專利]SCD基因敲除的豬胎兒成纖維細胞系及其構建方法

有效

• 申請號: 202010104600.8
• 申請日: 2020-02-20
• 公開（公告）號: CN111363743B
• 公開（公告）日: 2022-02-25
• 發明（設計）人: 王彥芳;劉璐璐;王煜;陶聰;梁小娟;劉嘉莉
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85;C12N15/90;C12N5/10;C12N15/11;C12Q1/6888;A01K67/027
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 黃爽

本發明提供SCD基因敲除的豬胎兒成纖維細胞系及其構建方法。利用CRISPR/Cas9系統編輯豬SCD基因，打靶位點位于SCD基因第二外顯子，可以有效地敲除SCD基因，得到SCD基因敲除豬胎兒成纖維細胞，該敲除細胞可用于制備SCD基因敲除豬以及深入研究SCD基因對豬脂肪沉積的影響，為闡明豬脂肪代謝機制提供理論基礎，亦為提高豬肉產量提供分子依據。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體地說，涉及SCD基因敲除的豬胎兒成纖維細胞系及其構建方法。

背景技術

硬脂酰輔酶A去飽和酶(Stearoyl-CoA desaturase,SCD)是一種微粒體膜結合蛋白，是調控脂肪合成過程中的關鍵酶，它是位于內質網上的一種跨膜蛋白，能催化飽和脂肪酸(Saturated Fatty Acid,SFA)形成單不飽和脂肪酸(Monounsaturated Fatty Acid,MUFA)，主要作用是調節脂肪的從頭合成以及催化棕櫚酸和硬脂酸生成棕櫚油酸和油酸。這一過程是通過一系列微粒體電子傳遞催化的，脂肪酸與NAD(P)H，經過細胞色素b5還原酶和細胞色素b5兩個電子的氧化作用，失去H₂O引入氫鍵，即在第9位和第10位碳原子引入雙鍵，催化SFA成為MUFA。目前為止，已經鑒定出很多物種的SCD基因，包括大鼠、小鼠、倉鼠、綿羊、山羊、牛、豬和人。豬的SCD基因有2個亞型(SCD1和SCD5)，SCD1主要在皮下脂肪中表達，SCD5是在大腦中表達量較高。SCD的表達受發育、飲食、激素和環境調節，調控因子如固醇調節元件結合蛋白1(sterol regulatory element-binding protein-1c,SREBP-1c)，肝X受體(liver X receptor,LXR)，碳水化合物反應元件結合蛋白(carbohydrate responseelement-binding protein，CHREBP)對SCD基因的表達起到正向調控作用。SCD參與MUFA的生成，能夠影響細胞膜流動性、脂質代謝，SCD活性的變化會改變SFA和MUFA的平衡。SCD還與一些慢性疾病的發生發展有關，如肥胖、癌癥、糖尿病、動脈粥樣硬化和高血脂癥等。

基因編輯技術是現代生物研究領域的重要技術。成簇的、規律間隔的短回文重復序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR)作為一種精確的分子工具可以進行定點基因組修飾，與之前的技術相比具有突變效率高、操作簡單、成本低等特點，能夠開發功能基因組發展的無限潛能。該技術可以有效的編輯真核生物基因組，并用于誘導多種修飾包括堿基定點插入/刪除、基因敲入、靶基因等位基因引入突變、刪除小DNA片段，能夠準確的對果蠅、酵母菌、小鼠、人體細胞、大鼠、斑馬魚和水稻進行基因修飾。其工作原理是，外源DNA的前間隔序列整合入宿主基因組中5’末端兩個重復序列之間，CRISPR轉錄得到前體非編碼RNA(pre-cursor non-coding RNA,pre-crRNA)，隨后長鏈pre-crRNA變為短鏈crRNA，短鏈crRNA與tracrRNA結合形成二級結構，與Cas9蛋白組成復合物，根據預先設計好的特定基因的單向導RNA(single guide RNA，sgRNA)序列，識別靶基因的間隔區序列鄰近基序(Protospacer Adjacent Motif,PAM)，以實現在特異位點剪切雙鏈DNA，觸發體內修復機制，通過非同源末端重組(Non-Homologous End Joining,NHEJ)修復方式可能出現小片段的插入或缺失產生移碼突變，從而實現目的基因的敲除。

發明內容

本發明的目的是提供SCD基因敲除的豬胎兒成纖維細胞系及其構建方法。

為了實現本發明目的，第一方面，本發明提供一種基于CRISPR/Cas9技術特異靶向豬SCD基因的sgRNA，sgRNA作用位點的核酸序列分別如SEQ ID NO:1和4所示。