[發明專利]一種使用轉錄因子FOXO1直接轉分化間充質干細胞為精子的方法

在審

• 申請號: 202010104321.1
• 申請日: 2020-02-20
• 公開（公告）號: CN111269940A
• 公開（公告）日: 2020-06-12
• 發明（設計）人: 馬廉
• 申請（專利權）人: 深圳市兒童醫院
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N3/00;C12N1/14;C12R1/885
• 代理公司: 上海申新律師事務所 31272
• 代理人: 郎祺

本發明提供的一種使用轉錄因子FOXO1直接轉分化間充質干細胞為精子的方法，其具體的步驟為：將轉錄因子FOXO1通過轉染的方式導入間充質干細胞，然后將間充質干細胞誘導培養為所述精子。該方法將轉錄因子FOXO1導入間充質干細胞，誘導其往精子方向發展，不僅有助于了解干細胞對機體生命活動的調控機制，探討維持精原干細胞SSCs動態平衡的信號通路，而且給男性不育，尤其是男性無精癥患者的治療帶來一種新的遺傳自己生物學信息的方案。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種使用轉錄因子FOXO1直接轉分化間充質干細胞為精子的方法。

背景技術

不孕不育癥是全球性的醫學和社會問題，全球約有10％-20％的育齡夫妻罹患不孕不育癥，其中男性因素又占比約50％，主要表現為無精癥和精子活力不足。

對于生精缺陷的不育患者來說，現有的藥物、手術以及輔助生殖技術等治療手段仍無法解決他們的生育問題。因此，研究精子發生發展過程中相關分子的調控機制，尋找患者自身來源的間充質干細胞使其發育成有功能性的生殖細胞用于男性不育癥的精準治療，是目前男性不育治療的研究熱點。

現有的研究結果已證明：間充質干細胞具有分化為男性生殖細胞的能力，目前多種不同的培養條件或者誘導方案可促使間充質干細胞往SSCs方向轉分化。

間充質干細胞經視黃酸誘導、與睪丸支持細胞共培養或移植到不育小鼠曲細精管內均能表達男性生殖細胞早期標記，但無法啟動減數分裂。間充質干細胞重編程成為誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cell，iPSCs)，經BMP4誘導后能表達減數分裂的相關標記，但細胞分化效率低下，無法檢測到下游的基因表達，尚未獲得成熟的精子。含有維甲酸和睪酮的睪丸細胞條件培養基中培養的間充質干細胞發生了形態學改變，并表達了Oct-4、α6整合素、Stella、C-kit和VASA等生殖細胞標志物。人臍帶間充質干細胞、人羊膜上皮細胞和絨毛膜板胎盤細胞共同培養，并添加骨形態發生蛋白4(BMP4)及視黃酸(RA)加以誘導培養得到蝌蚪樣形狀的精原細胞樣細胞。在間充質干細胞與Sertili細胞體外共培養的實驗中，我們得到了類似精原干細胞樣的圓形細胞團，并且表達少數的生殖細胞標記。用BMP4將間充質干細胞誘導成擬胚體(EB)，再從EB培養出增殖減慢的圓形的細胞，表達SSEA-1和PRDM1等PGC的特異性標記，再篩選出SSEA-1⁺的細胞，鋪于小鼠胚胎成纖維細胞的飼養層上與BMP4誘導培養，細胞形態改變成精子樣，且表達雄性生殖細胞標記物PLZF、GFRa1、DMRT1等，免疫熒光顯示頂體素Acrosin陽性。

綜上所述，在目前已存在的多種不同的可促使間充質干細胞往SSCs方向轉分化的培養條件或者誘導方案中，所能檢測到的標記僅限于男性生殖細胞的早期標記，尚未檢測到細胞進入減數分裂階段的標記，也未能獲得發育成熟的具有功能的男性生殖細胞。

發明內容

本發明針對現有技術的不足，提供了一種使用轉錄因子FOXO1直接轉分化間充質干細胞為精子的方法。

為實現上述目的，本發明采用以下技術方案：

本發明提供的一種使用轉錄因子FOXO1直接轉分化間充質干細胞為精子的方法，其具體的步驟為：將轉錄因子FOXO1通過轉染的方式導入間充質干細胞，然后將所述間充質干細胞培養為精子。

進一步地，將上述轉錄因子FOXO1通過慢病毒轉染的方式導入所述間充質干細胞，包括如下步驟：

步驟一，計算每孔加入攜帶有FOXO1基因的慢病毒的添加量，然后將所述慢病毒加入含有間充質干細胞的培養基中，再添加促轉染劑，進行轉染；

步驟二，轉染一段時間且細胞已較好地恢復后，去掉原培養基，換用篩選培養基進行篩選培養一段時間，獲得穩定細胞株。