[發(fā)明專利]一種使用轉(zhuǎn)錄因子FOXO1直接轉(zhuǎn)分化間充質(zhì)干細(xì)胞為精子的方法

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• 申請日: 2020-02-20
• 公開（公告）號: CN111269940A
• 公開（公告）日: 2020-06-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 馬廉
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳市兒童醫(yī)院
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N3/00;C12N1/14;C12R1/885
• 代理公司: 上海申新律師事務(wù)所 31272
• 代理人: 郎祺

1.一種使用轉(zhuǎn)錄因子FOXO1直接轉(zhuǎn)分化間充質(zhì)干細(xì)胞為精子的方法，其特征在于，具體的步驟為：將轉(zhuǎn)錄因子FOXO1通過轉(zhuǎn)染的方式導(dǎo)入間充質(zhì)干細(xì)胞，然后將所述間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)為所述精子。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種使用轉(zhuǎn)錄因子FOXO1直接轉(zhuǎn)分化間充質(zhì)干細(xì)胞為精子的方法，其特征在于，將所述轉(zhuǎn)錄因子FOXO1通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方式導(dǎo)入所述間充質(zhì)干細(xì)胞，包括如下步驟：

步驟一，計算每孔加入攜帶有FOXO1基因的慢病毒的添加量，然后將所述慢病毒加入含有間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基中，再添加促轉(zhuǎn)染劑，進(jìn)行轉(zhuǎn)染；

步驟二，轉(zhuǎn)染一段時間且細(xì)胞已較好地恢復(fù)后，去掉原培養(yǎng)基，換用篩選培養(yǎng)基進(jìn)行篩選培養(yǎng)一段時間，獲得穩(wěn)定細(xì)胞株。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種使用轉(zhuǎn)錄因子FOXO1直接轉(zhuǎn)分化間充質(zhì)干細(xì)胞為精子的方法，其特征在于，步驟一中所述促轉(zhuǎn)染劑為聚凝胺。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種使用轉(zhuǎn)錄因子FOXO1直接轉(zhuǎn)分化間充質(zhì)干細(xì)胞為精子的方法，其特征在于，步驟二中所述篩選培養(yǎng)基為含有潮霉素B的培養(yǎng)基。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種使用轉(zhuǎn)錄因子FOXO1直接轉(zhuǎn)分化間充質(zhì)干細(xì)胞為精子的方法，其特征在于，將所述轉(zhuǎn)錄因子FOXO1通過電轉(zhuǎn)染的方式導(dǎo)入所述間充質(zhì)干細(xì)胞，包括如下步驟：

步驟一，選取在對數(shù)生長期的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行消化、沖洗、重懸計數(shù)后，和攜帶FOXO1基因的質(zhì)粒混合加入電轉(zhuǎn)杯中；

步驟二，將步驟一所述的電轉(zhuǎn)杯置于電轉(zhuǎn)杯架上，設(shè)置電轉(zhuǎn)染參數(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種使用轉(zhuǎn)錄因子FOXO1直接轉(zhuǎn)分化間充質(zhì)干細(xì)胞為精子的方法，其特征在于，將所述轉(zhuǎn)錄因子FOXO1通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方式導(dǎo)入所述間充質(zhì)干細(xì)胞，包括如下步驟：

步驟一，將含有脂質(zhì)體的混合液A與含有FOXO1基因質(zhì)粒的混合液B進(jìn)行充分混合，形成含有DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物的轉(zhuǎn)染混合液；

步驟二，將所述間充質(zhì)干細(xì)胞加入所述轉(zhuǎn)染混合液中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)7-9h；

步驟三，培養(yǎng)后，換上含有FBS的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，再置于細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育至轉(zhuǎn)染完成。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種使用轉(zhuǎn)錄因子FOXO1直接轉(zhuǎn)分化間充質(zhì)干細(xì)胞為精子的方法，其特征在于，步驟一中所述混合液A還包括Opti-MEM培養(yǎng)基。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種利用光照誘導(dǎo)提高液體發(fā)酵木霉菌產(chǎn)孢量的方法，其特征在于，步驟一中所述混合液B還包括Opti-MEM培養(yǎng)基和增強(qiáng)劑。