[發明專利]一種土壤中微生物磷脂脂肪酸的固液相高效分離方法

在審

• 申請號: 202010104037.4
• 申請日: 2020-02-20
• 公開（公告）號: CN111117774A
• 公開（公告）日: 2020-05-08
• 發明（設計）人: 李娜;龍靜泓;盛明
• 申請（專利權）人: 中國科學院東北地理與農業生態研究所
• 主分類號: C11C1/00
• 分類號: C11C1/00
• 代理公司: 哈爾濱市文洋專利代理事務所(普通合伙) 23210
• 代理人: 何強

一種土壤中微生物磷脂脂肪酸的固液相高效分離方法，它涉及一種土壤中磷脂脂肪酸的固液分離方法，本發明是為了解決現有固液相分離不完全、雜質高、誤差大、測定精度低的問題的技術問題。本方法如下：將樣加入到帶蓋玻璃試管中，加入檸檬酸鈉緩沖液、甲醇、氯仿和Blight?Dyer提取液，蓋上玻璃蓋，渦旋，靜止，離心，用長嘴膠頭吸管吸取上清液轉移到另一個帶蓋玻璃試管中，沉淀，將沉淀后的濾渣，再提取2次，收集所有上清液并合并，即完成固液相分離。本發明與采用常規提取方法相比檢測效率提高8?12％，檢出率提高7?10％。本發明屬于土壤中微生物磷脂脂肪酸的固液分離技術領域。

技術領域

本發明涉及一種土壤中磷脂脂肪酸的固液分離方法，尤其是適用于高有機質含量的土壤中微生物細胞中磷脂脂肪酸的提取分離。

背景技術

磷脂脂肪酸(phospholipid fatty acids,PLFA)是微生物細胞膜的主要組成成分。它只存在于活體微生物細胞中，當微生物死亡后，磷脂會隨著細胞膜的降解而消失。該指標能指示不同微生物群落，如細菌、真菌、放線菌和原核生物的群落數量和結構，可用于分析活體微生物群落結構特征，目前已被廣泛應用于特定條件下土壤生態系統中微生物群落結構的分析。且隨著現代分析技術的發展，該指標可以結合¹³C同位素失蹤技術(¹³C-PLFA)，通過質譜分析特定微生物的細胞膜中來源于外源添加有機物質的¹³C豐度和量，定量化研究不同類群的微生物對有機物質的分解利用能力，進而評價不同類群微生物的功能和屬性。

目前，中國發明專利已有關于土壤磷脂脂肪酸提取裝置或提取方法的闡述，但是都沒有對土壤磷脂脂肪酸提取中土壤相和有機相的分離方法進行詳細闡述。提取時土壤磷脂脂肪酸是否被全部提取進入有機相，有機相與固體相是否完全分離，會直接影響后續測定數據的準確性和精度，也影響對不同類群微生物群落結構和功能的準確判讀。特別地，對于高有機質含量的黑土，其內常常含有大量腐殖化程度較高但未完全變為土壤有機質的植物殘體，這部分高分子的化合物密度較低，如果前處理不當，經過氯仿-甲醇相提取液提取，來源于植物的磷脂會進入到有機相中，剩余的植物殘體往往會漂浮在固相和有機相界面處，對后續的固液相分離也造成一定的干擾，使土壤磷脂脂肪酸的提取不徹底。申請人在實踐中，針對該提取過程中的固體相和有機相不能完全分離，對提取裝置和提取方法進行了部分改進，提高了土壤磷脂脂肪酸的提取分離程度，最終找到了利于高有機質含量黑土磷脂脂肪酸充分分離的方法。

發明內容

本發明的目的是為了解決現有固液相分離不完全、雜質高、誤差大、測定精度低的問題的技術問題，提供了一種土壤中微生物磷脂脂肪酸的固液相高效分離方法。

一種土壤中微生物磷脂脂肪酸的固液相高效分離方法按照以下步驟進行：

一、配制Blight-Dyer提取液：

將氯仿、甲醇和檸檬酸按照1:2:0.8的體積比混合，即得Blight-Dyer提取液；

二、將3g冷凍干燥土樣加入到帶蓋玻璃試管中，加入1.5ml檸檬酸鈉緩沖液、3.8ml甲醇、1.9ml氯仿和2ml Blight-Dyer提取液，蓋上玻璃蓋，得混合液，所述檸檬酸鈉緩沖液濃度為0.15mol/L，pH值為4；

三、將步驟二的混合液渦旋2min，靜止2h，以3000rpm離心10min，用長嘴膠頭吸管吸取上清液轉移到另一個帶蓋玻璃試管中，沉淀；

四、向沉淀后的濾渣內，加入1.5ml檸檬酸鈉緩沖液、3.8ml甲醇、1.9ml氯仿和2mlBlight-Dyer提取液，蓋上玻璃蓋，得混合液，所述檸檬酸鈉緩沖液濃度為0.15mol/L，pH值為4；

混合液渦旋2min，靜止2h，以3000rpm離心10min，用長嘴膠頭吸管吸取上清液轉移到另一個帶蓋玻璃試管中，沉淀；