[發(fā)明專利]一種表達拉沙熱病毒空衣殼的重組病毒及其制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010103832.1
• 申請日: 2020-02-20
• 公開（公告）號: CN111206022A
• 公開（公告）日: 2020-05-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 趙忠鵬;李靖;李敏;李霄;焦俊;楊曉嵐;谷宏婧;張真;申夢;劉媛
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/863;C12N15/40;C07K14/08;C12N15/63;A61K39/12;A61K39/285;A61K39/275;A61P31/14;A61P31/20;C12R1/93
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 白鳳瑩

本發(fā)明公開了一種表達拉沙熱病毒空衣殼的重組病毒及其制備方法。本發(fā)明首先公開了一種重組病毒的構(gòu)建方法，包括如下步驟：將轉(zhuǎn)移質(zhì)粒與痘病毒共轉(zhuǎn)染宿主細胞，得到重組病毒；所述轉(zhuǎn)移質(zhì)粒包含以痘病毒嚴格的非必需區(qū)基因的上、下游同源臂為基礎(chǔ)構(gòu)建的重組DNA分子，所述重組DNA分子包括拉沙熱病毒結(jié)構(gòu)蛋白Z、GPC和NP基因。本發(fā)明進一步還公開了上述構(gòu)建得到的重組病毒及其應(yīng)用。本發(fā)明重組病毒通過敲除嚴格的非必需區(qū)提高了臨床應(yīng)用的安全性，能穩(wěn)定存在且在早、晚期全程高效產(chǎn)生拉沙熱病毒空衣殼；將該疫苗免疫小鼠和恒河猴，均能產(chǎn)生高滴度的抗拉沙熱病毒抗體，阻斷拉沙熱病毒假病毒對敏感細胞的感染。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及免疫學(xué)及基因工程領(lǐng)域。具體涉及一種表達拉沙熱病毒空衣殼的重組病毒及其制備方法。

背景技術(shù)

拉沙熱(Lassa fever)是一種急性烈性病毒性(Lassavirus，LASV)傳染病，據(jù)統(tǒng)計，每年感染者20～50萬人，造成0.5～1萬人死亡，受威脅人口達3700萬。目前尚沒有批準(zhǔn)的商業(yè)化拉沙熱疫苗，眾多拉沙熱候選疫苗尚處于實驗室研究階段。

LASV是一種兩節(jié)段的單股負鏈RNA，分別是3.4kb的S鏈和7.2kb的L鏈，編碼5個結(jié)構(gòu)蛋白。S鏈的兩個基因編碼核蛋白NP、糖蛋白GP1和GP2。L鏈的兩個基因編碼病毒聚合酶蛋白(L)和Z蛋白。GP1與GP2蛋白，是由G因編碼的前體糖蛋白GPC經(jīng)翻譯后裂解而來，以四聚體形式構(gòu)成表面纖突，與病毒的中和作用有關(guān)。LASV根據(jù)GPC和NP基因分為五個基因型和多個血清型，不同型病毒之間可能有一定的交叉保護，但無法達到完全保護。

應(yīng)用病毒樣顆粒和重組病毒載體作為疫苗逐漸商業(yè)化，特別是在生物安全要求高的急性烈性病毒疫苗中受到格外重視。

隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，特別是1982年，Paoletti和Moss首次成功應(yīng)用痘苗病毒作為載體在哺乳動物中表達外源基因以來，該載體被廣泛用于重組活病毒載體疫苗的研究。1987年，表達狂犬病病毒G基因的重組痘苗病毒首先獲準(zhǔn)在野生動物中使用，并成功控制了歐洲和北美地區(qū)野生動物狂犬病；1994年美國批準(zhǔn)批量生產(chǎn)表達新城疫病毒的HN和F蛋白基因的重組痘苗病毒疫苗，成為第一個商業(yè)活載體疫苗；1995年美國農(nóng)業(yè)部正式批準(zhǔn)重組雞痘病毒活載體苗VAX FP-N的商品化。

隨著重組痘病毒在獸醫(yī)藥領(lǐng)域的成功應(yīng)用，現(xiàn)開始傾向于開發(fā)具有宿主特異性的痘病毒載體，如金絲雀痘病毒、豬痘病毒、羊痘病毒等；而在醫(yī)藥領(lǐng)域，痘病毒因其具有重要的經(jīng)濟價值、良好的安全性而成為重組病毒載體熱點之一，1996年美國啟動了用于治療惡性黑色素瘤的重組痘苗病毒Aldesleukin的I期臨床試驗，并于2001年完成了該項目的II期臨床試驗，迄今，全球有百余項以重組痘苗病毒為生物制劑的研究處于醫(yī)學(xué)臨床試驗階段，涉及癌癥、烈性傳染病等多種疾病的預(yù)防和治療領(lǐng)域，如2019年4月T601(重組溶瘤痘苗病毒注射液)取得臨床批件。

痘苗病毒基因組由線性、雙股DNA所組成的，AT含量約為75％，病毒核酸無感染力。和其他痘病毒一樣，痘苗病毒基因組包括中間編碼區(qū)和兩端相同的反向末端重復(fù)序列，其編碼147個開放閱讀框，編碼密度為93％。痘苗病毒作為病毒載體的優(yōu)點:作為預(yù)防或治療性生物制劑的安全性已被大量的動物和人體試驗證明；基因組容量大，可以插入25Kbp的外源基因；重組痘病毒表達的蛋白存在加工、修飾及轉(zhuǎn)移過程，抗原性保存較好；宿主范圍廣，痘病毒能感染包括人、鼠等在內(nèi)的大多數(shù)哺乳動物，也可以在相應(yīng)的疫苗生產(chǎn)細胞系中繁殖，特別適合作為預(yù)防人獸共患傳染病及自然疫源性傳染病的載體。另外，痘病毒特別適合在發(fā)展中國家推廣使用，痘病毒較為穩(wěn)定，凍干成本低、易于保存，從而易于生產(chǎn)和使用，重組痘苗病毒疫苗還易于區(qū)分自然感染和免疫接種個體。

目前尚沒有一種以重組病毒為載體的拉沙熱病毒空衣殼候選疫苗，能交叉保護任一基因型或血清型的拉沙熱病毒感染，對于保護多種基因型或血清型的拉沙熱病毒感染的疫苗尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容