[發明專利]一種原核表達載體及其構建方法和應用

在審

• 申請號: 202010102716.8
• 申請日: 2020-02-19
• 公開（公告）號: CN111172185A
• 公開（公告）日: 2020-05-19
• 發明（設計）人: 郭抗抗;趙娣;張亮;張彥明;劉勇
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/66;C12P21/02;C07K14/18
• 代理公司: 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 王敏

本發明公開了一種原核表達載體及其構建方法和應用，屬于基因工程技術領域。本發明公開的一種原核表達載體，以pET?32a為原始載體，在其基礎上進行改造；雙酶切pET?32a原核表達載體，并合成兩條含rbs序列及分別含有BamHⅠ、EcoRⅠ的酶切位點的單鏈，退火形成帶缺口的雙鏈，進而連入雙酶切的pET?32a原核表達載體，形成僅含單一his標簽的原核表達載體pET?32a?gai。PCR擴增C蛋白的基因序列，將其連入pET?32a?gai原核表達載體形成pET?32a?gai?C原核表達載體。本發明的原核表達載體將在外源小分子蛋白(特別是豬瘟病毒石門株衣殼蛋白C)表達的生產中發揮重要作用。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，更具體的說是涉及一種原核表達載體及其構建方法和應用。

背景技術

豬瘟(CSF)是由豬瘟病毒(CSFV)引起的一種豬的高度接觸性傳染病，除北美洲和大洋洲外幾乎遍及全世界，是危害養豬業安全的重要疫病之一。C蛋白是CSFV編碼的第一個結構蛋白，構成病毒的核衣殼，在病毒的增殖過程中發揮重要作用。研究發現，C蛋白上存在的抗原表位對T、B淋巴細胞介導的免疫反應有重要作用，但不能誘導機體產生中和性抗體。己經證實與CSFV同科的牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)的C蛋白具有免疫原性，丙型肝炎病毒的C蛋白已經被用于臨床感染治療和疫苗研發。由此推測CSFV的C蛋白可能具有與之相似的免疫學特性和功能。因此，C蛋白在基礎研究與臨床應用上具有重要價值。豬瘟病毒C蛋白抗體是進行CSFV研究的重要材料，且市場上很難買到好用的C蛋白抗體，所以自制C蛋白抗體非常必要，而C蛋白的原核表達為C蛋白抗體的制備奠定了重要的材料基礎。

因此，提供一種原核表達載體及其構建方法和應用是本領域技術人員亟需解決的問題。

發明內容

有鑒于此，本發明提供了一種原核表達載體及其構建方法和應用。

為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種原核表達載體，是由pET-32a改造獲得的僅含單一his標簽的原核表達載體。所述原核表達載體為pET-32a-gai，它是雙鏈環狀DNA，長度約為5.4Kb；是表達his標簽的誘導型原核表達載體。

進一步，一種原核表達載體，是誘導帶his標簽的小分子蛋白表達的載體；其僅含一個his標簽，免于所表達的蛋白因標簽太大而結構被標簽覆蓋。

進一步，一種原核表達載體的構建方法，通過雙酶切將大標簽切掉，連接形成僅含his標簽的原核表達載體，具體步驟如下：

(1)以pET-32a為原始載體，利用Xho Ⅰ(CTCGAG)、Xba Ⅰ(TCTAGA)雙酶切pET-32a原核表達載體；

(2)合成兩條含rbs序列(AAGGAG)及分別含有BamH Ⅰ(GGATCC)、EcoR Ⅰ(GAATTC)的酶切位點的單鏈，退火形成帶缺口的雙鏈；

所述兩條單鏈序列分別為：

a：5’-CTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATA TGGGATCCGCGGAATTCC-3’；SEQ ID NO.1；

b：5’-TCGAGGAATTCCGCGGATCCCATATGTATATCTCCTTCTTAA AGTTAAACAAAATTATTT-3’；SEQ ID NO.2；

(3)將步驟(2)合成的雙鏈與步驟(1)雙酶切的pET-32a原核表達載體連接，經轉化、培養、測序，獲得僅含單一his標簽的原核表達載體pET-32a-gai。