[發明專利]一種原核表達載體及其構建方法和應用在審
| 申請號： | 202010102716.8 | 申請日： | 2020-02-19 |
| 公開（公告）號： | CN111172185A | 公開（公告）日： | 2020-05-19 |
| 發明（設計）人： | 郭抗抗;趙娣;張亮;張彥明;劉勇 | 申請（專利權）人： | 西北農林科技大學 |
| 主分類號： | C12N15/70 | 分類號： | C12N15/70;C12N15/66;C12P21/02;C07K14/18 |
| 代理公司： | 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465 | 代理人： | 王敏 |
| 地址： | 712100 *** | 國省代碼： | 陜西;61 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 表達 載體 及其 構建 方法 應用 | ||
1.一種原核表達載體，其特征在于，是由pET-32a改造獲得的僅含單一his標簽的原核表達載體。
2.根據權利要求1所述的一種原核表達載體的構建方法，其特征在于，具體步驟如下：
(1)以pET-32a為原始載體，利用XhoⅠ、XbaⅠ雙酶切pET-32a原核表達載體；
(2)合成兩條含rbs序列及分別含有BamHⅠ、EcoRⅠ的酶切位點的單鏈，退火形成帶缺口的雙鏈；
所述兩條單鏈序列分別為：
a：5’-CTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGGATCCGCGGAATTCC-3’；SEQID NO.1；
b：5’-TCGAGGAATTCCGCGGATCCCATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACAAAATTATTT-3’；SEQID NO.2；
(3)將步驟(2)合成的雙鏈與步驟(1)雙酶切的pET-32a原核表達載體連接，經轉化、培養、測序，獲得僅含單一his標簽的原核表達載體pET-32a-gai。
3.根據權利要求2所述的一種原核表達載體的構建方法，其特征在于，步驟(2)將兩條單鏈序列95℃-60℃依次梯度退火，每個梯度5℃，每個梯度退火5min，形成一條有缺口的雙鏈。
4.根據權利要求3所述的一種原核表達載體的構建方法，其特征在于，步驟(3)所述連接為使用T4連接酶過夜連接。
5.根據權利要求4所述的一種原核表達載體的構建方法，其特征在于，步驟(3)所述轉化為用CaCl2法轉入大腸桿菌DH5α感受態細胞。
6.權利要求1-5所述的原核表達載體在表達外源小分子蛋白中的應用。
7.根據權利要求6所述的原核表達載體在表達外源小分子蛋白中的應用，其特征在于，所述外源小分子蛋白為豬瘟病毒石門株衣殼蛋白C。
8.一種表達豬瘟病毒石門株衣殼蛋白C的方法，其特征在于，利用權利要求1-7所述的原核表達載體進行誘導表達，具體步驟如下：
(1)PCR擴增C蛋白的基因片段；
(2)將獲得的基因片段與pET-32a-gai原核表達載體連接，獲得pET-32a-gai-C原核表達載體；
(3)將pET-32a-gai-C導入宿主細胞，IPTG誘導表達得到帶his標簽的C蛋白。
9.根據權利要求8所述的一種表達豬瘟病毒石門株衣殼蛋白C的方法，其特征在于，所述宿主細胞為大腸桿菌。
10.根據權利要求9所述的一種表達豬瘟病毒石門株衣殼蛋白C的方法，其特征在于，所述大腸桿菌為BL21。
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