[發(fā)明專(zhuān)利]一種免清洗通用型ELISA熒光免疫探針及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010102128.4
• 申請(qǐng)日: 2020-02-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111257554B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-07-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊婷;王怡婷;王建華
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 東北大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): G01N33/533
• 分類(lèi)號(hào): G01N33/533;G01N33/543;G01N33/58;G01N33/68;G01N33/573;G01N33/574;G01N33/53
• 代理公司: 北京君泊知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11496
• 代理人: 李丹

1.一種免清洗通用型ELISA熒光免疫探針的制備方法，其特征在于，所述熒光免疫探針的制備方法包括以下步驟：

(1)g-C₃N₄粉末的合成：將1-5g雙氰胺于氧化鋁坩堝中，蓋上蓋子并用鋁箔紙包裹密封，放入馬弗爐中，以3℃min^-1的速度升溫至550℃并保持2h；待反應(yīng)物冷卻至室溫取出，所得淡黃色固體即為g-C₃N₄，用瑪瑙研缽將所述g-C₃N₄研磨成均勻固體粉末，備用；

(2)硼酸修飾：取4-羧基苯硼酸和HBTU于無(wú)水DMF中，攪拌使其溶解，并在50℃下繼續(xù)攪拌30-60min，得到混合物；隨后向所述混合物中加入所述g-C₃N₄和DIEA，50℃下繼續(xù)攪拌12-16h完成反應(yīng)；將反應(yīng)后的產(chǎn)物離心收集，并依次用無(wú)水乙醇和二次水各清洗2-3次，60℃下烘干得BCN；

(3)用超聲輔助液體剝離法將所述BCN剝離成BCN納米片BCNNS：取所述BCN于錐形瓶中，加入二次水配成濃度為1mg mL^-1的懸浮液；之后連續(xù)超聲10h；隨后將超聲所得奶白色懸浮液在3000rpm轉(zhuǎn)速下離心15min，收集上清；將所述上清在14000rpm轉(zhuǎn)速下離心10min，收集沉淀，即為BCNNS；將所述BCNNS冷凍干燥后稱(chēng)重，配成0.2mg mL^-1的BCNNS分散液，備用；

(4)抗體標(biāo)記：將抗體用含0.5-2％BSA的PBS溶液稀釋至10-100μg mL^-1，且所述含0.5-2％BSA的PBS溶液的pH為7.2-7.6，取50μL所述抗體加入到100μL 0.2mg mL^-1 BCNNS分散液中，混合均勻后在室溫下振蕩反應(yīng)10min，隨后繼續(xù)加入50μL的1-10μmol L^-1葡萄糖溶液，在室溫下振蕩8-20min，得到混合體系；最后將所述混合體系在14000rpm轉(zhuǎn)速下離心10min，保留下層沉淀并重懸于200μL PBS中，即得到抗體標(biāo)記的BCNNS，即為Ab-BCNNS。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種免清洗通用型ELISA熒光免疫探針的制備方法，其特征在于，步驟(1)中所述雙氰胺的用量為3g。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種免清洗通用型ELISA熒光免疫探針的制備方法，其特征在于，步驟(2)中所述4-羧基苯硼酸(4-CPBA)、HBTU和DIEA的反應(yīng)摩爾比為1：1～1.5：1～3。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種免清洗通用型ELISA熒光免疫探針的制備方法，其特征在于，步驟(2)中硼酸修飾的具體參數(shù)為：取166mg 4-羧基苯硼酸和400mg HBTU于30mL無(wú)水DMF中，攪拌使其溶解，并在50℃下繼續(xù)攪拌30min，得到混合物；隨后向所述混合物中加入100mg所述g-C₃N₄和0.5mL DIEA，50℃下繼續(xù)攪拌12h完成反應(yīng)。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種免清洗通用型ELISA熒光免疫探針的制備方法，其特征在于，步驟(3)中所述連續(xù)超聲的功率為800W。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種免清洗通用型ELISA熒光免疫探針的制備方法，其特征在于，步驟(4)中所述抗體稀釋方法為將所述抗體用含0.5％BSA的PBS溶液稀釋至10μg mL^-1，且所述含0.5％BSA的PBS溶液的pH為7.4。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種免清洗通用型ELISA熒光免疫探針的制備方法，其特征在于，步驟(4)中所述葡萄糖溶液的濃度為1μmol L^-1。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種免清洗通用型ELISA熒光免疫探針的制備方法，其特征在于，步驟(4)中所述加入50μL的1-10μmol L^-1葡萄糖溶液，在室溫下振蕩的時(shí)間為10min。