[發明專利]一種免清洗通用型ELISA熒光免疫探針及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 202010102128.4
• 申請日: 2020-02-19
• 公開（公告）號: CN111257554B
• 公開（公告）日: 2021-07-09
• 發明（設計）人: 楊婷;王怡婷;王建華
• 申請（專利權）人: 東北大學
• 主分類號: G01N33/533
• 分類號: G01N33/533;G01N33/543;G01N33/58;G01N33/68;G01N33/573;G01N33/574;G01N33/53
• 代理公司: 北京君泊知識產權代理有限公司 11496
• 代理人: 李丹

本發明提供了一種免清洗通用型ELISA熒光免疫探針及其制備方法和應用，其特征在于，通過HBTU/DIEA偶聯反應，將羧基苯硼酸修飾到g?C₃N₄上，后經超聲剝離，可得到弱熒光的硼酸修飾的石墨相氮化碳納米片(BCNNS)，再將抗體(Ab)標記到BCNNS上，可得到強熒光的Ab?BCNNS復合材料(ON)，隨著目標抗原的加入，Ab?BCNNS復合材料的熒光發生猝滅現象(OFF)，基于這種ON?OFF現象，即可實現對目標抗原的特異性檢測；而且通過改變Ab?BCNNS中的標記抗體，即可實現對不同目標抗原的選擇性檢測。

技術領域

本發明屬于分析檢驗技術領域，涉及一種免疫檢測方法，具體涉及一種免清洗通用型ELISA熒光免疫探針及其制備方法和應用。

背景技術

生物標志物一般是指可供客觀測定和評價的生理、病理、治療過程中的某種特征的生化指標。通過對生物標志物的測定能夠獲知機體當前所處生物學過程的進程。生物標志物的檢查，對于疾病的鑒定、早期診斷及預防、治療過程的監控能夠起到一定的幫助作用。

因此，尋找和發現有價值的生物標志物已經成為相關領域的研究熱點，而在對生物標志物研究的過程中人們發現關鍵的問題是：如何提高對生物標志物檢測的準確性。

在提高準確性的研究中，基于抗原-抗體特異性識別的免疫分析以其在復雜樣品檢測中的高靈敏、高選擇性，已成功應用于各種生物標志物的檢測。其中，酶聯免疫吸附測定(ELISA)由于其良好的選擇性和靈敏度、簡單的操作手法、以及可外帶測試等優勢在臨床分析、藥物分析、毒物分析等領域得到了廣泛應用。但是，ELISA檢測過程中涉及到涂板、洗滌、封閉、孵育、檢測等多個步驟，不僅勞動強度大、試劑用量多，而且耗時長，導致診斷延遲，所以應用結果較差。

因此，研究人員致力于開發更快速、更簡單、更靈敏的免疫測定方法。例如，基于電化學(ECL)或表面等離子體共振(SPR)的免標記免疫分析法，基于ECL或SPR的競爭免疫分析法等。然而，這些新開發的方法通常需要復雜的化學反應機制，所以這些方法還需要進一步的改進和完善才能實現廣泛應用。

發明內容

為了彌補現有技術的不足，本發明提供了一種免清洗通用型ELISA熒光免疫探針及其制備方法和應用，采用抗體(Ab)標記的BCNNS(Ab-BCNNS)為熒光探針，對目標抗原進行選擇性檢測，通過改變Ab-BCNNS中的標記抗體，可實現對不同目標抗原的選擇性檢測。

一種免清洗通用型ELISA熒光免疫探針的制備方法，其特征在于，所述熒光免疫探針的制備方法包括以下步驟：

(1)g-C₃N₄粉末的合成：將1-5g雙氰胺于氧化鋁坩堝中，蓋上蓋子并用鋁箔紙包裹密封，放入馬弗爐中，以3℃min^-1的速度升溫至550℃并保持2h；待反應物冷卻至室溫取出，所得淡黃色固體即為g-C₃N₄，用瑪瑙研缽將所述g-C₃N₄研磨成均勻固體粉末，備用；

(2)硼酸修飾：取4-羧基苯硼酸和HBTU于無水DMF中，攪拌使其溶解，并在50℃下繼續攪拌30-60min，得到混合物；隨后向所述混合物中加入所述g-C₃N₄和DIEA，50℃下繼續攪拌12-16h完成反應；將反應后的產物離心收集，并依次用無水乙醇和二次水各清洗2-3次，60℃下烘干得BCN；

(3)用超聲輔助液體剝離法將所述BCN剝離成BCN納米片BCNNS：取所述BCN于錐形瓶中，加入二次水配成濃度為1mg mL^-1的懸浮液；之后連續超聲10h；隨后將超聲所得奶白色懸浮液在3000rpm轉速下離心15min，收集上清；將所述上清在14000rpm轉速下離心10min，收集沉淀，即為BCNNS；將所述BCNNS冷凍干燥后稱重，配成0.2mg mL^-1的BCNNS分散液，備用；