[發明專利]一種載脂蛋白J活性的測定方法

在審

• 申請號: 202010101385.6
• 申請日: 2020-02-19
• 公開（公告）號: CN113278678A
• 公開（公告）日: 2021-08-20
• 發明（設計）人: 陳翔;杜佩云;蔡文凱
• 申請（專利權）人: 廈門德馨尚品醫療科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/48
• 分類號: C12Q1/48;G01N33/92;G01N21/31
• 代理公司: 北京市中聯創和知識產權代理有限公司 11364
• 代理人: 王錚;張松林

本發明提供了一種載脂蛋白J活性的測定方法，向谷胱甘肽S?轉移酶中加入適量的載脂蛋白J，通過測定谷胱甘肽S?轉移酶在熱處理條件處理前、后的比活的變化來計算載脂蛋白J的活性。本發明首次利用載脂蛋白J能夠抑制蛋白在加熱后形成聚集和沉淀的特性，通過檢測在加熱前后谷胱甘肽S?轉移酶的活性變化，來測定載脂蛋白J的比活性，相關操作簡單，精確度高。

技術領域

本發明涉及檢測技術領域，特別涉及一種載脂蛋白J活性的測定方法。

背景技術

載脂蛋白J(ApoJ,又稱clusterin)是一種多功能的糖蛋白，廣泛存在于人體多種組織及體液中。載脂蛋白J是一種相對分子質量為75～80KDa的異質二聚體蛋白質，能夠與人血漿高密度脂蛋白(HDL)和極高密度脂蛋白(VHDL)相結合。載脂蛋白J的功能復雜，參與包括補體功能的調節、抑制凋亡和炎癥、參與脂質的運輸等多種體內生理過程，目前已經發現載脂蛋白J在多種疾病過程中都有高度表達，如神經退行性病變、動脈粥樣硬化、心肌梗死、腫瘤等。

分子伴侶是一類與其他蛋白不穩定構象相結合并使之穩定的蛋白，它們通過控制結合和釋放來幫助被結合多肽在體內的折疊、組裝、轉運或降解等。1997年有報道稱，載脂蛋白J啟動子中的一個14bp的元件，其序列在脊椎動物中是嚴格保守的，被轉錄因子HSF1特異性識別，并能在瞬時表達分析中介導熱休克誘導的轉錄，這說明載脂蛋白J是一種熱休克蛋白。載脂蛋白J和小熱休克蛋白(sHsps)是一類功能相似的分子伴侶蛋白，盡管它們之間缺乏明顯的序列相似性。這兩個分子伴侶蛋白都能有效地阻止目標蛋白在應激條件下的形成聚集和沉淀，如升高的溫度、還原和氧化。研究表明，ApoJ蛋白可以抑制蛋白淀粉樣變性聚集相關途徑，這些淀粉樣變性聚集蛋白包括谷胱甘肽S-轉移酶(GST)等蛋白。例如在生理濃度下，載脂蛋白J能有效保護谷胱甘肽S-轉移酶和過氧化氫酶不受熱沉淀的影響，并能有效保護α-乳蛋白和牛血清白蛋白不受二硫蘇糖醇還原沉淀的影響。除此之外，載脂蛋白J還能夠抑制未稀釋的人血清中應激誘導的蛋白質沉淀。載脂蛋白J通過不依賴ATP的機制發揮分子伴侶作用，不可逆地與應激蛋白結合形成可溶的高分子量復合物，保持受體蛋白空間穩定，減少由于環境因素導致受體蛋白錯誤折疊。在此過程中，它們作用于緩慢的、不折疊的蛋白質途徑。這兩種蛋白的構象動態和聚集狀態可能對其伴侶功能起著至關重要的作用。亞基交換可能在調節伴侶作用中起重要作用；蛋白質的游離形式可能是體現伴侶活性的主要形態，而非聚集狀態。

GST在生物體內是一種重要的解毒酶系，其催化外源或內源性毒素與谷胱甘肽結合，形成易溶于水或毒性較小的化合物排除體外，從而保護機體的正常功能。Amy R.Wyatt等人發現ApoJ蛋白能夠顯著性抑制GST因熱處理而變性聚集，從而保持GST的空間構象。但是沒有指出載脂蛋白J是否對GST的酶活性也有保護作用。Rebecca A等人提供一個定量描述蛋白熱變性實驗方法，即在高溫處理環境中，GST將因熱聚集變性形成蛋白錯誤折疊聚集，且蛋白聚集程度在360nm處有最大光吸收值。故而360nm吸光值可以反映GST聚集折疊程度或者熱變性程度。GST活性測定原理是在GST的催化下1,2-二氯-4-硝基苯(CDNB)分子上的氯原子與谷胱甘肽上的巰基發生親電反應，產物在340nm、344nm處有吸收，通過紫外分光光度計可以進行酶活測定。為驗證載脂蛋白J保護GST活性，我們利用此方法檢測加熱后在載脂蛋白J存在的情況下，GST活性的變化，并在此基礎上建立了一套用于測定載脂蛋白J活性的方法。

發明內容

有鑒于此，本發明旨在提出一種載脂蛋白J活性的測定方法，利用載脂蛋白J具有類似熱激蛋白的分子伴侶功能能夠抑制蛋白在加熱后形成聚集和沉淀的作用，通過檢測在加熱處理過程中GST的活性變化情況來定義載脂蛋白J的活性，以解決目前尚沒有快速、準確測定載脂蛋白J活性方法的問題。

為達到上述目的，本發明的技術方案是這樣實現的：

一種載脂蛋白J活性的測定方法，向GST中加入適量的載脂蛋白J，通過測定GST在熱處理條件處理前、后的比活的變化來計算載脂蛋白J的活性。所述載脂蛋白J可以使天然載脂蛋白，也可以是重組表達的載脂蛋白。