[發(fā)明專利]一種新型CRISPR Cas13a-gRNA表達(dá)載體及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010096220.4
• 申請(qǐng)日: 2020-02-17
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111304249B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-11-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王進(jìn)科;高金良
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 東南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/85
• 分類號(hào): C12N15/85;C12N15/90;A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 南京蘇高專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32204
• 代理人: 孫斌

本發(fā)明公開(kāi)了一種新型CRISPR Cas13a?gRNA表達(dá)載體及其應(yīng)用。CRISPR Cas13a?gRNA表達(dá)載體由NF?κB特異性啟動(dòng)子DMP和U6啟動(dòng)子分別控制Cas13a和gRNA的表達(dá)形成；Cas13a?gRNA表達(dá)載體的gRNA 5′端為可靶向特定基因mRNA的28nt序列，其產(chǎn)生的gRNA可引導(dǎo)Cas13a蛋白結(jié)合并切割特定基因的mRNA，造成特定基因表達(dá)抑制。本發(fā)明構(gòu)建了的新型CRISPR Cas13a?gRNA表達(dá)載體可特異性敲低促癌基因在癌細(xì)胞中的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和凋亡，但不影響正常細(xì)胞的靶基因表達(dá)及生長(zhǎng)；本發(fā)明的表達(dá)載體可應(yīng)用在制備新型癌癥基因治療試劑中。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及癌癥基因治療生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及新型CRISPR Cas13a-gRNA表達(dá)載體及其在癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

癌癥是困擾人類健康和威脅人類生命的重要疾病。在于癌癥的長(zhǎng)期斗爭(zhēng)中，人類已經(jīng)發(fā)展了手術(shù)、化療、靶向治療、免疫治療等多種癌癥治療手段，也取得了顯著的進(jìn)步，癌癥生存率顯著提高。但目前癌癥治療的水平，仍然于廣大患者對(duì)健康和生命的期望存在很大的距離。因此，積極發(fā)展新型癌癥治療技術(shù)仍是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的持續(xù)努力的目標(biāo)。基因治療是未來(lái)醫(yī)學(xué)的前沿領(lǐng)域和技術(shù)高地，基因治療在遺傳病治療領(lǐng)域取得的進(jìn)展已經(jīng)受到醫(yī)學(xué)界的矚目，但該技術(shù)用于癌癥治療尚沒(méi)有顯著突破。因此，探索癌癥單基因治療技術(shù)也發(fā)展新型癌癥治療技術(shù)的主要突破口。

癌癥基因治療，顧名思義，就是通過(guò)向癌細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入遺傳物質(zhì)，通過(guò)遺傳物質(zhì)發(fā)揮治療作用，干擾癌細(xì)胞生長(zhǎng)或殺滅癌細(xì)胞。特別是向細(xì)胞中導(dǎo)入某種基因，通過(guò)表達(dá)基因產(chǎn)物如干擾RNA或蛋白，引發(fā)癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制或凋亡、壞死。基因治療中兩個(gè)問(wèn)題至關(guān)重要，一是基因的選擇，直接決定治療效率；二是控制基因只在癌細(xì)胞中表達(dá)，即癌細(xì)胞特異性。相對(duì)而言，基因的選擇問(wèn)題不大，基于目前基因組科學(xué)對(duì)大量基因功能的研究，不少基因特別是編碼干擾RNA及其抑癌蛋白的基因，導(dǎo)入細(xì)胞后其表達(dá)產(chǎn)物都會(huì)或多或少產(chǎn)生對(duì)癌細(xì)胞的抑制作用。最關(guān)鍵的是如何控制基因只在癌細(xì)胞中表達(dá)，即癌細(xì)胞特異性。目前基于合成生物學(xué)原理，已經(jīng)發(fā)展了一些基因開(kāi)關(guān)，用于控制基因在癌細(xì)胞中的特異性表達(dá)，但這些基因控制元件構(gòu)成復(fù)雜、效率較低，與應(yīng)用還有較大的距離。

在申請(qǐng)人過(guò)去的研究中，申請(qǐng)人基于對(duì)重要炎癥及癌癥相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的大量研究，構(gòu)建了一種NF-κB特異性啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子由NF-κB誘騙(Decoy)序列與最小啟動(dòng)子(Minimal Promoter)連接而成，被稱為DMP啟動(dòng)子(專利申請(qǐng)?zhí)朇N201710812983.2)(Int JBiochem Cell Biol.2018,95:43–52；Control the intracellular NF-κB activity by asensor consisting of miRNA and decoy)。因此，該啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活活性主要取決于細(xì)胞中的NF-κB活性。由于NF-κB在各種癌癥中都被過(guò)度激活，因此證明了該啟動(dòng)子可以在多種癌細(xì)胞中特異性地驅(qū)動(dòng)效應(yīng)基因的表達(dá)，而在正常細(xì)胞中不表達(dá)(專利申請(qǐng)?zhí)朇N201711335257.2、CN201810163823.4)(Hum Gene Ther.2019,30:471-484；A Cell-Specific Nuclear Factor-Kappa B-Activating Gene Expression Strategy forDelivering Cancer Immunotherapy)。因此，DMP啟動(dòng)子是一種癌細(xì)胞特性啟動(dòng)子，其能控制其下游基因只在癌細(xì)胞中表達(dá)，而不在正常細(xì)胞中表達(dá)。該啟動(dòng)子在未來(lái)癌癥基因治療領(lǐng)域具有廣泛而重要的應(yīng)用價(jià)值。