[發(fā)明專利]一種新型CRISPR Cas13a-gRNA表達(dá)載體及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010096220.4
• 申請日: 2020-02-17
• 公開（公告）號: CN111304249B
• 公開（公告）日: 2022-11-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王進(jìn)科;高金良
• 申請（專利權(quán)）人: 東南大學(xué)
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/90;A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 南京蘇高專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32204
• 代理人: 孫斌

1.一種CRISPR Cas13a-gRNA表達(dá)載體，其特征在于，由DMP啟動(dòng)子和U6啟動(dòng)子分別控制Cas13a和gRNA的表達(dá)，構(gòu)建新型CRISPR Cas13a-gRNA表達(dá)載體；所述CRISPR Cas13a-gRNA表達(dá)載體產(chǎn)生的gRNA為同時(shí)靶向多個(gè)基因的gRNA；所述gRNA同時(shí)靶向基因TERT、EZH2和RelA的mRNA，該gRNA的5′端序列為5′-CCCTC TTTTC TCTGC GGAAC GTTCT GGCGA AACACCGATT TAGAC TACCC CAAAA ACGAA GGGGA CTAAA ACCGG CTTTC TTTAT CATCT CGGTG ATCCTGAAAC ACCGA TTTAG ACTAC CCCAA AAACG AAGGG GACTA AAACC CTCTT TCTGC ACCTT GTCACACAGT AG-3′。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CRISPR Cas13a-gRNA表達(dá)載體，其特征在于，所述DMP啟動(dòng)子是一種NF-κB特異性啟動(dòng)子，由NF-κB誘騙子和最小啟動(dòng)子連接形成，該啟動(dòng)子可激活其下游基因在各種癌細(xì)胞中表達(dá)，而不在正常細(xì)胞中表達(dá)；所述DMP啟動(dòng)子可激活Cas13a基因在癌細(xì)胞中表達(dá)，而不在正常細(xì)胞中表達(dá)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CRISPR Cas13a-gRNA表達(dá)載體，其特征在于，所述U6啟動(dòng)子為一種真核細(xì)胞RNA聚合酶III識別啟動(dòng)子，可激活gRNA在真核細(xì)胞中的表達(dá)。

4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的CRISPR Cas13a-gRNA表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體的功能元件為DMP-Cas13a-U6-gRNA；所述功能元件DMP-Cas13a-U6-gRNA的序列如SEQID NO.1所示。

5.一種權(quán)利要求1所述的CRISPR Cas13a-gRNA表達(dá)載體在制備新型癌癥基因治療試劑中的應(yīng)用。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述Cas13a-gRNA表達(dá)載體可被包裝進(jìn)腺相關(guān)病毒或者溶瘤病毒等病毒顆粒，用于通過皮下、瘤內(nèi)或者靜脈等方式注射進(jìn)體內(nèi)，進(jìn)行體內(nèi)癌細(xì)胞的生長抑制。