[發明專利]一種基于比色法檢測生物樣品中NAD+

在審

• 申請號: 202010096170.X
• 申請日: 2020-02-17
• 公開（公告）號: CN111269957A
• 公開（公告）日: 2020-06-12
• 發明（設計）人: 鞠振宇
• 申請（專利權）人: 寧波荷仁健康科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/32
• 分類號: C12Q1/32;C12Q1/00;G01N21/78
• 代理公司: 北京知匯林知識產權代理事務所(普通合伙) 11794
• 代理人: 董濤

本申請公開了一種用于檢測生物樣品中NAD⁺含量的反應液，所述反應液包含反應液包含雙苷肽，八肽膽囊收縮素(CCK?8)，乙醇脫氫酶，煙酰胺和無水乙醇。本發明還提供了相應的試劑盒和檢測方法。本發明提供的反應液和檢測方法可以檢測低至0.1μmol/L的NAD⁺，在0～1000nmol/L之間呈良好的線性關系，靈敏度更高，線性范圍更寬。對于科學研究和臨床評價都有著重要作用。

技術領域

本發明屬于生物檢測技術領域，特別涉及一種基于比色法檢測細胞及組織內NAD⁺含量的方法及其應用。

背景技術

NAD(Nicotinamide Adenine Dinucleotide)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，廣泛存在于生命體內。NAD有兩種存在形式，一種是氧化形式NAD⁺，另一種是還原形式NADH。在細胞內大部分氧化還原反應中起傳遞電子的作用。因此，維持適量水平的NAD對于機體的細胞呼吸功能非常重要。NAD有三種重要的合成途徑：①是從頭合成途徑，通過限速酶NAMPT(Nicotinamide phosphoribosyltransferase)煙酰胺磷酸核糖轉移酶來維持；②Preis-Handler passway，合成原料為食物中方攝取的煙酸(nicotinic acid)；③挽救途徑，通過循環使用降解的NAD產物，比如煙酰胺。隨著年齡的增長，NAD⁺和NAMPT 在多個組織器官中的水平都明顯下降。NAD⁺的消失是細胞死亡的主要原因。 NAD在調節細胞氧化還原狀態以及調控細胞信號轉中都發揮重要的作用。

但目前的NAD檢測方法對樣品要求較高，需要在較短的時間內完成所有檢測操作；顯色的穩定性、靈敏度有待提高，當前的科學研究和臨床評價亟需更好的NAD⁺含量的檢測方法。

發明內容

針對上述技術問題，本發明的首要目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種顯色穩定、靈敏度高的檢測NAD⁺含量的反應液，同時提供一種更穩定、更靈敏的基于比色法檢測NAD⁺含量的方法。

本發明公開了，一種用于檢測生物樣品中NAD⁺含量的反應液，所述反應液包含反應液包含雙苷肽，八肽膽囊收縮素，其中各組分的濃度為：

雙苷肽50mmol/L～100mmol/L；

CCK-8 0.1ml/L～0.5ml/L；

乙醇脫氫酶10單位/L～15單位/L；

煙酰胺100mmol/L～150mmol/L；

無水乙醇5％～10％。

根據本發明提供的反應液通過用CCK-8顯色產生的甲瓚更加穩定且更易溶解于水，反應產物更加穩定，靈敏度更高。同時，本發明在顯色方面相比 MTT法更為穩定，本發明的CCK-8法顯色在顯色后1小時內讀數都可以得到很好的標準曲線圖；同時，結合本發明在研究過程中檢測人外周血實驗結果來看，當血液樣品加入0.5mol/L高氯酸后放入-80℃保存，在2個月內檢測依舊穩定、靈敏、準確。

在根據本發明的一個實施方案中，所述的反應液為每毫升包含820μL 的61mmol/LpH7.4的雙苷肽，100μL CCK-8，5μL 2.6千單位/mL乙醇脫氫酶，28.5μL的3.5mol/L煙酰胺，57μL無水乙醇。

本發明還提供了一種用于檢測NAD⁺含量的試劑盒，所述試劑盒包含上述的反應液、樣品裂解劑和pH中和劑。

在根據本發明的一個實施方案中，所述試劑盒中的樣品裂解劑為高氯酸，所述pH劑中和劑為堿性試劑，優選地，所述pH中和劑為KOH水溶液或NaOH 水溶液。