[發(fā)明專利]一種基于比色法檢測生物樣品中NAD+

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• 申請日: 2020-02-17
• 公開（公告）號: CN111269957A
• 公開（公告）日: 2020-06-12
• 發(fā)明（設計）人: 鞠振宇
• 申請（專利權(quán)）人: 寧波荷仁健康科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/32
• 分類號: C12Q1/32;C12Q1/00;G01N21/78
• 代理公司: 北京知匯林知識產(chǎn)權(quán)代理事務所(普通合伙) 11794
• 代理人: 董濤

1.一種用于檢測生物樣品中NAD⁺含量的反應液，其特征在于，所述反應液包含雙苷肽、八肽膽囊收縮素、乙醇脫氫酶、煙酰胺和無水乙醇，其中各組分的濃度為：

雙苷肽 50mmol/L～100mmol/L；

CCK-8 0.1ml/L～0.5ml/L；

乙醇脫氫酶 10單位/L～15單位/L；

煙酰胺 100mmol/L～150mmol/L；

無水乙醇 5％～10％。

2.如權(quán)利要求1所述的反應液，其特征在于，所述的反應液為每毫升包含820μL的61mmol/L pH7.4的雙苷肽，100μL CCK-8，5μL 2.6千單位/mL乙醇脫氫酶，28.5μL的3.5mol/L煙酰胺，57μL無水乙醇。

3.一種用于檢測NAD⁺含量的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含如權(quán)利要求1或2所述的反應液、樣品裂解劑和pH中和劑。

4.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述樣品裂解劑為高氯酸，所述pH劑中和劑為堿性試劑，優(yōu)選地，所述pH中和劑為KOH水溶液或NaOH水溶液。

5.一種基于比色法檢測生物樣品中NAD⁺含量的方法，其特征在于，包括以下步驟：

將待測生物樣品與權(quán)利要求1或2所述的反應液進行顯色反應，顯色穩(wěn)定后在波長450nm處測定吸光值；

根據(jù)由若干個濃度梯度的NAD⁺標準品溶液建立的NAD⁺濃度與吸光值的標準曲線，計算得到待測生物樣品中的NAD⁺含量。

6.如權(quán)利要求5所述的基于比色法檢測生物樣品中NAD⁺含量的方法，其特征在于，所述的待測生物樣品在與反應液反應前先在裂解液中進行裂解處理，在裂解處理后將pH調(diào)節(jié)到中性，然后將中性混合液離心得到的上清液，再將所述上清液與反應液進行顯色反應；優(yōu)選地，所述的裂解液為高氯酸；更優(yōu)選地，所述裂解液為濃度0.5mol/L高氯酸水溶液。

7.如權(quán)利要求5或6所述的基于比色法檢測生物樣品中NAD⁺含量的方法，其特征在于：

所述的待測生物樣品選自細胞樣品、血液樣品或組織樣品；

優(yōu)選地，所述的血液包括外周血；

優(yōu)選地，所述的組織樣品選自腦、心臟、肌肉、脂肪、肝臟、脾臟、腎臟、骨髓、胸腺、肺中的一種。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的基于比色法檢測生物樣品中NAD⁺含量的方法，其特征在于，

當所述的樣品為細胞時，去除培養(yǎng)基后，加入高氯酸進行裂解；

當所述的樣品為血液樣品時，進行抗凝處理后，加入到高氯酸中裂解，至血液呈暗紅棕色；

當所述的樣品為組織樣品時，將組織樣品與高氯酸混合，進行低溫研磨。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的基于比色法檢測生物樣品中NAD⁺含量的方法，其特征在于：

當所述的樣品為細胞時，按每2×10⁶細胞配比480μL高氯酸進行裂解；

當所述的樣品為血液樣品時，按每100μL以內(nèi)的血液樣品配比480μL高氯酸進行裂解；

當所述的樣品為組織樣品時，所述的高氯酸的用量為使組織樣品被高氯酸完全浸沒。

10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基于比色法檢測生物樣品中NAD⁺含量的方法，其特征在于，當所述的樣品為組織樣品時，所述的高氯酸按480μL高氯酸配比如下質(zhì)量范圍的組織樣品進行裂解：

組織	取樣質(zhì)量范圍
肝臟	7.5mg～8.5mg，
肌肉	9.5mg～10.5mg，
脂肪	30mg～35mg，
腦	9.5mg～10.5mg，
心臟	7.5mg～8.5mg，
脾臟	9.5mg～10.5mg，
肺	7.5mg～8.5mg，
腎臟	7.5mg～8.5mg，
胸腺	9.5mg～10.5mg

當所述的樣品為血液樣品時，按每40μL血液樣品配比480μL高氯酸進行裂解。